煙粉虱細胞色素P450基因CYP6JM1的克隆及其在噻蟲嗪抗性中的作用

關鍵詞煙粉虱；噻蟲嗪；細胞色素P450;噻蟲嗪抗性

煙粉虱是世界范圍內主要的經濟害蟲之一，能夠對眾多寄主植物表現出極強的適應性和侵害能力。煙粉虱對農作物的危害主要通過以下3種方式實現：一是直接吸食植物的汁液；二是通過排泄蜜露導致煤污病的發生；三是作為植物病毒的傳播媒介。目前煙粉虱的防治手段以化學防治為主，然而鑒于煙粉虱體積微小，且傾向于隱藏在植物葉片背面進行為害，這使得觸殺型殺蟲劑難以發揮充分的防治作用，而新煙堿類藥劑作為一種內吸性殺蟲劑，對刺吸式口器害蟲具有較為出色的防治效果。噻蟲嗪屬于第二代新煙堿類殺蟲劑，其兼具觸殺性和內吸性，對具有刺吸式口器的害蟲極為有效，這種藥劑在全球范圍內得到了廣泛應用，特別是在針對煙粉虱等以刺吸為食的害蟲防治上取得了顯著成效。然而，長期不合理地使用噻蟲嗪，已引起煙粉虱對該殺蟲劑產生不同程度的抗性反應。根據我國當前田間煙粉虱抗性監測的資料顯示，自2007年以來，田間煙粉虱種群對噻蟲嗪已經產生了不同程度的抗性，且抗性水平有逐年遞增的趨勢。

有研究指出，靶標抗性和代謝抗性是昆蟲抵御新煙堿類藥劑的2種主要途徑。以靶標抗性為例，褐飛虱和蚜蟲體內乙酰膽堿受體亞基的突變，顯著增強了它們對新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉的抗性。煙粉虱對新煙堿類殺蟲劑主要表現為代謝抗性，即能夠將藥劑代謝成親水性更強且毒力更低的物質，如煙粉虱體內的細胞色素P450基因CYP6CM1的過量表達，促使其將吡蟲啉轉化為羥基吡蟲啉，實現了對吡蟲啉的代謝轉化。前期也有研究對比了煙粉虱噻蟲嗪抗性和敏感種群間各項指標的差異，如UDP-葡萄糖醛酸轉移酶、細胞色素P450、ABC轉運蛋白以及谷胱甘肽S-轉移酶等。細胞色素P450基因CYP6CX2、CYP6CX3與煙粉虱對噻蟲嗪抗性密切相關，可能參與了將噻蟲嗪代謝為去甲基化的甲基三嗪酮衍生物的代謝過程。另一個細胞色素P450基因CYP4C64上游的5'-UTR區域存在一個噻蟲嗪抗性偏好性突變位點，該位點是RNA甲基化（m6A）的識別位點，并且能夠調控該基因的表達，從而導致煙粉虱對噻蟲嗪產生抗性。

為了進一步探究細胞色素P450的作用，本研究克隆和分析煙粉虱CYP6JM1基因在煙粉虱不同發育階段和不同部位的相對表達量，并通過RNAi技術，結合抗藥性生物測定，系統評估該基因在煙粉虱中對噻蟲嗪抗性中的作用。

1材料與方法

1.1供試蟲源及主要試劑

供試煙粉虱在中國農業科學院蔬菜花卉研究所溫室以棉花為寄主長期飼養。噻蟲嗪敏感種群采自北京昌平，飼養期間不施用任何殺蟲劑；噻蟲嗪抗性種群采自中國不同地區并通過藥劑篩選保持抗藥性，其中有2個種群采自海南省三亞市（R1、R2）、有1個種群采自海南省三沙市（R3）。溫室飼養條件：溫度（25±1）℃、相對濕度（70±5）%、光周期L∥D=14h∥10h。

噻蟲嗪（thiamethoxam）原藥，上海源葉生物科技公司；TRIzoI試劑，賽默飛世爾科技有限公司；反轉錄試劑盒PrimeScript⑥RT reagent Kit （RealTime）、FastReal快速熒光定量PCR預混試劑（SYBR Green），北京天根生化科技有限公司；dsR-NA合成試劑盒T7 RiboMAX Express RNAi Sys-tem，普洛麥格生物技術有限公司；Transl-T1感受態細胞、PCR產物純化試劑盒、pEASY-Blunt Clo-ning Kit，北京全式金生物技術有限公司。其他實驗室常用化學試劑（分析純）均為市售。

1.2試驗方法

1.2.1噻蟲嗪對煙粉虱的毒力測定

煙粉虱成蟲生物測定采用Liang等的飼喂法。先將噻蟲嗪原藥用丙酮配制成10000mg/L的母液，再用營養液（5%酵母提取物和30%蔗糖）稀釋至待測濃度。將65uL稀釋液滴加在玻璃管（長50mm，直徑15mm）頂端封口膜的外表面上，再拉伸一層封口膜將稀釋液包裹在兩層封口膜中間。用吸蟲管從煙粉虱飼養籠中吸取20頭左右煙粉虱成蟲，輕輕吹至封好稀釋液的玻璃管中，再將另一開口端封好并扎孔以透氣。根據煙粉虱趨光的特性，將封好的玻璃管放人黑色遮光套中（長50mm，直徑20mm），將含有稀釋液的一端向光放置在培養箱內，培養箱條件為溫度（25±1）℃、相對濕度（70±5）%、光周期L//D=14h∥10h。采用梯度稀釋法設置6個質量濃度的噻蟲嗪藥液處理煙粉虱，對抗性種群濃度，分別設置為0、12.5、25、50、100、200、400mg/L;對敏感種群，濃度設置為0、0.78125、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25mg/L，每個質量濃度設置4個生物學重復，空白對照組只滴加65uL營養液。48 h后，統計玻璃管中煙粉虱總數及死亡數，并計算每個處理的死亡率。用細毛筆撥動煙粉虱，若其不能正常行動，則判定其死亡。

1.2.2CYP6JMI基因克隆

參照TRIzoI試劑盒說明書提取RNA，然后利用反轉錄試劑盒合成cDNA。根據煙粉虱基因組序列，利用Primer Premier 5．O軟件設計CYP6JMI基因特異性擴增引物CYP6JMI-F、CYP6JMI-R（表1），由北京擎科生物科技有限公司合成。以cDNA為模板，進行PCR擴增反應，反應體系：共35個循環；72℃終延伸5min。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分析，并在紫外燈下準確切下單一目標片段進行純化，將純化后的產物與pEASY-Blunt克隆載體進行連接反應。將連接產物轉入Trans1-T1感受態細胞，采用藍白斑篩選法挑選出含有目標片段的單克隆陽性菌落進行擴增。將擴增得到的菌液樣品送至北京擎科生物科技股份有限公司進行測序，并通過NCBI數據庫分析并比對序列。

1.2.3CYP6JMI基因表達量分析

收集敏感種群煙粉虱的不同發育階段和敏感種群煙粉虱成蟲的不同組織樣品，包括卵、1～4齡若蟲、成蟲，以及成蟲的頭部、胸部和腹部。該基因在不同發育階段的表達量以卵期表達量為對照，在不同組織的表達量以成蟲頭部表達量為對照。為確保試驗結果的可靠性并具有統計學意義，每種樣品均進行了4次獨立的生物學重復采集。

卵和若蟲的采集：轉移噻蟲嗪敏感煙粉虱種群成蟲至新的棉花苗，當煙粉虱在葉片背面產卵后，使用細軟的毛筆輕柔地將卵粒刷下以完成收集，約2000粒卵為一個生物學重復。待煙粉虱卵發育至1～2齡若蟲后，用昆蟲針在顯微鏡下收集，3齡和4齡若蟲同樣如此以保證煙粉虱樣品的齡期一致性，約200頭若蟲為一個生物學重復。

成蟲的收集：用吸蟲管吸取煙粉虱成蟲置于1.5ml RNase-Free離心管中，約50頭為一個生物學重復。

成蟲頭、胸、腹的收集：用吸蟲管吸取單頭煙粉虱成蟲置于1.5mL離心管中，經過液氮短暫處理后，在顯微鏡下使用昆蟲針將煙粉虱按照頭、胸、腹3個部位截成3段，分類放人裝有1mL TRIzoI的1.5mL RNase-Free離心管中。

將樣品迅速用液氮進行冷凍處理，然后置于-80℃冰箱保存并采用1.2.2的方法提取總RNA。取1ug（根據所提取的RNA濃度計算所需體積）總RNA反轉錄合成cDNA，置于-80℃冰箱保存備用．作為后續熒光定量PCR的模板。基于測序獲得的CYP6JM1基因的完整序列，設計了多對用于熒光定量PCR的引物。經擴增效率篩選后，選定了CYP6JM1-qF/-qR作為定量PCR的特異性引物（表1）。為了確保數據的準確性，選擇了煙粉虱的核糖體蛋白L29（ribosomal protein L29，RPL29）和延伸因子（elongation factors-1a，EF-1a）作為內參基因，進行雙重校正。熒光定量PCR使用SYBRGreen染料，反應體系的上、下游引物各；程序：95℃預變性10min; 95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個循環。采用2倍梯度稀釋的cDNA為模板獲得的值計算特異性引物的擴增效率。根據法對煙粉虱在不同生長時期、成蟲各部位以及噻蟲嗪抗性與敏感性群體中CYP6JM1基因表達水平的變化進行定量分析。

1.2.4RNA干擾及生物測定

參照T7 RiboMAX Express RNAi System說明書合成dsCYP6JMI以及作為對照的外源基因dsGFP，進行RNAi。煙粉虱RNAi采用飼喂法。將營養液（30%的蔗糖和5%的酵母浸出物溶液）和雙鏈RNA按照所需濃度配制成含有dsRNA的飼喂液備用。采用1.2.1描述的飼喂法處理煙粉虱。dsCYP6JM1和dsGFP濃度均為0.8ug/pL，每處理設置3個生物學重復。

經RNA干擾24h后，取剩余狀態良好的成蟲采用飼喂法進行煙粉虱生物測定。用營養液將10000mg/L的噻蟲嗪母液稀釋成50mg/L的飼喂液，對RNA干擾后的煙粉虱進行飼喂處理，每個處理設置3個重復，每個重復約40頭煙粉虱，24h后檢查活蟲數量。

1.3數據分析

試驗數據均采用DPS數據處理系統進行分析。采用單因素方差分析方法（ANOVA），對煙粉虱在不同發育階段、不同身體部位，以及在噻蟲嗪抗性與敏感性種群間的基因表達水平差異進行統計分析，并用Tukey法進行多重比較。采用PoIoPlus軟件分析生物測定數據，計算LC50。

2結果與分析

2.1不同煙粉虱種群對噻蟲嗪的抗性水平

通過比較田間種群與室內敏感種群煙粉虱的LC50，來確定它們的抗性倍數。抗性倍數一田間種群的LC50/室內敏感種群的LC50。室內敏感種群煙粉虱的LC50于2023年測得，飼養期間未接觸過任何形式的殺蟲劑。依據Torres-Vila的分類標準，殺蟲劑抗性水平（RF）劃分為以下幾類：敏感（RF：1）；低抗（RF：2～10）；中抗（RF：11～30）；高抗（RF：31～100）；超高抗（RF：大于100）。結果如表2所示，田間種群R1、R2、R3均達到了中抗至高抗水平。

2.2CYP6JM1基因克隆及序列分析

利用煙粉虱的cDNA作為模板，通過基因克隆技術成功獲得了CYP6JMI基因的完整開放閱讀框（ORF）序列，該序列包含1623個堿基，與已登記的基因組序列相吻合（基因組序列登錄號：BTA03183）。序列分析表明，CYP6JM1基因編碼540個氨基酸，其結構內包括5個內含子和6個外顯子。該蛋白質中存在多個細胞色素P450家族的典型保守結構域，包括位于133-137位氨基酸的Helix-CWXXXR區域、位于340-344位氨基酸的GxE/DTT/S區域、位于373-376位氨基酸的ExLR區域、位于453-459位氨基酸的Mean-der PXXFXP區域和位于474-484位氨基酸的Heme-binding區域，這些保守結構域的存在表明它屬于昆蟲P450基因家族的成員。通過系統發育樹（圖1）可以看出，煙粉虱CYP6JM1基因與P450家族CYP6亞族的其他CYP6基因具有較為緊密的進化親緣性。

2.3CYP6JM1基因在煙粉虱噻蟲嗪敏感種群不同發育階段和組織中的表達水平

由RT-qPCR結果可知，CYP6JM1基因在煙粉虱1～2齡若蟲時期高表達，在4齡若蟲期表達量最低（圖2a）。該基因在煙粉虱成蟲胸部表達最低，在腹部表達量最高（圖2b）。

2.4CYP6JM1基因在噻蟲嗪抗性和敏感種群的表達水平

通過對不同煙粉虱種群的基因表達水平進行分析后發現，CYP6JM1基因在所測定的3個噻蟲嗪抗性種群中均過量表達，最高可達6.32倍（圖3a），與敏感種群差異極顯著，由此可推測，CYP6JM1基因的過量表達可能在煙粉虱對噻蟲嗪的抗藥性形成過程中起到了關鍵作用。

2.5RNA干擾及干擾后的生物測定

使用0.8ug/uL的dsCYP6JM1和dsGFP飼喂液分別處理R2種群48h后，相較于dsGFP喂養的對照組，dsCYP6JM1喂養的煙粉虱成蟲體內的CYP6JM1基因表達量顯著下降了63.5%（圖3b），干擾效率較高。在這一結果的基礎上，進行干擾后的生物測定，對dsCYP6JM1和dsGFP飼喂48h后的成蟲進行藥劑處理，濃度為50mg/L。結果顯示，在3個噻蟲嗪抗性種群中，dsGFP處理的對照組在24h的死亡率分別達到了27.4%、39.7%和27.2%，而dsCYP6JMI處理組24 h的死亡率分別為59.9%、73.5%、79.9%，顯著高于對照組（圖3c）。

3結論與討論

煙粉虱作為一種世界性農業害蟲，于20世紀90年代在我國首次發現，特別是2003年發現的Q型煙粉虱，憑借其更強的適應性和生態競爭力，迅速成為了農業生產中的一大難題。Q型煙粉虱不僅繁殖速度快，抗藥性強，而且其對環境的適應能力也顯著提高，使得防控工作變得更加復雜和困難。目前煙粉虱防治手段以化學防治為主，新煙堿類殺蟲劑對煙粉虱有一定的防治效果。噻蟲嗪作為新一代煙堿類殺蟲劑，自20世紀末便在我國農業生產中被廣泛使用。它通過干擾害蟲的神經系統，有效控制了煙粉虱的種群數量，一度被認為是對抗煙粉虱的有效武器。盡管噻蟲嗪在農業生產中發揮了重要作用，但其長期且大規模的應用導致了煙粉虱對其產生了逐漸增長的抗性。這種抗性的形成，不僅降低了噻蟲嗪的防治效果，也使得煙粉虱的控制變得更加困難。早期的研究結果表明，細胞色素P450基因在煙粉虱對噻蟲嗪抗性形成過程中扮演了關鍵角色。Xie等于2012年發現了一個CYP4-Iike基因，該基因在煙粉虱噻蟲嗪抗性種群中顯著過量表達，據此推測該基因極有可能與煙粉虱對噻蟲嗪產生抗性有關。Yang等的研究同樣發現了2個細胞色素P450基因，CYP6CX2和CYP6CX3，這兩個基因經RNAi后，煙粉虱對噻蟲嗪的敏感性顯著提升，這一發現表明CYP6CX2和CYP6CX3基因可能在煙粉虱對噻蟲嗪產生抗性的生理機制中發揮了關鍵作用。

煙粉虱是一種常見的農業害蟲，可對農作物造成嚴重的危害。為探究煙粉虱對噻蟲嗪的抗性機制，本文對細胞色素P450基因CYP6JMI進行了深入研究。研究結果表明，該基因在煙粉虱1～2齡若蟲期間以及腹部表達量較高。推測該基因可能會導致煙粉虱成蟲與1～2齡若蟲對噻蟲嗪產生抗性，并在煙粉虱的中腸解毒過程中發揮作用，這一發現為研究煙粉虱的抗性機制提供了新的線索。為了驗證該基因的功能，對煙粉虱成蟲進行了RNA干擾試驗，研究發現CYP6JM1基因表達水平的下降能夠增強煙粉虱對噻蟲嗪的敏感程度。這一結果進一步印證了CYP6JM1基因在煙粉虱形成抗藥性過程中的關鍵作用。因此，我們推斷CYP6JM1基因在煙粉虱對噻蟲嗪抗性的發展中起到了至關重要的調節作用。