梨火疫病菌的RPA快速檢測技術的研發

關鍵詞梨火疫病；快速檢測；重組酶聚合酶擴增（RPA）；實時熒光型RPA;側流層析試紙條型RPA

梨火疫病1780年在美國紐約州首次發現，當時人們認為是雷電、凍傷、熱灼傷、昆蟲，甚至是人類病原菌引起的。1884年美國伊利諾伊大學的Burr-ill教授通過分離與再接種試驗證實了該病是由一種細菌引起的，這也是世界上最早被發現的一種植物細菌病害。梨火疫病菌在寄主上主要有4種存在形式：菌膿、菌束、表生細菌、內生細菌，其中菌膿是梨火疫病菌最常見的存在形式。梨火疫病菌的寄主范圍廣泛，可以侵染40多個屬的220多種植物。植物的花朵、幼果和葉片在受到梨火疫病菌侵染之后會很快變成黑褐色的焦枯狀，像被火燒過一樣，造成果樹大面積減產。

截至2020年底根據歐洲和地中海植物保護組織（European and Mediterranean Plant ProtectionOrganization，EPPO）數據顯示，梨火疫病在美洲、歐洲、非洲、亞洲以及大洋洲的60多個國家發生與分布口。我國近年來也不斷從國外批量進口果樹苗木以及果品，稍有不慎就可能將梨火疫病菌帶入我國。2019年，李洪濤等通過室內接種幼果和離體枝條的方法評價了市面上常見的20個梨品種對梨火疫病菌的抗病能力，結果顯示：供試的梨品種中沒有發現高抗品種，其中70%品種不同程度地感病，因此對于梨火疫病菌的檢疫應引起高度重視。

梨火疫病菌的檢測方法目前主要是組織分離培養、免疫學檢測以及分子檢測。組織分離培養是對有明顯發病癥狀的植物材料采用半選擇性培養基直接分離病原菌，再根據梨火疫病菌在不同培養基上的菌落生長特征做出初步鑒定。免疫學檢測包括：凝集反應、免疫磁珠分離技術、酶聯免疫分析技術和免疫熒光技術等。分子檢測是當前應用最廣的檢測方法。近幾年，在傳統PCR檢測的基礎上又開發了real-time PCR、巢式PCR、免疫捕獲PCR和免疫吸附PCR技術，進一步提高了檢測的便捷性和準確率。

重組酶聚合酶擴增（recombinase polymeraseamplification，RPA）是Piepenburg等在2006年提出的一種多酶恒溫核酸擴增技術，可以快速便捷地進行核酸檢測分析。在25～43℃的恒溫條件下，應用RPA技術能在5～20min內實現特定核酸序列的擴增并觀察到結果。檢測RPA擴增產物的方法主要有5種：瓊脂糖凝膠電泳（AGE）檢測、實時熒光重組酶聚合酶擴增檢測（real-time RPA）、染料SYBR Green I檢測、側流層析試紙條型重組酶聚合酶擴增檢測（RPA-LFD）、酶聯免疫吸附檢測（ELISA-RPA）。其中，real-time RPA和RPA-LFD因其靈敏度高、操作簡單，可以在5～20min內觀察到結果，適合基層現場開展簡單快速的初步篩查而被廣泛應用。張皖靜成功地建立并優化了大麥黃花葉病毒（barley yellow mo-saic vlrus，BaYMV）的RPA檢測方法，在37℃反應8 min時可達到最佳檢測效果，目標序列的檢測限可達到10-3ng/pL。丁鈿等基于RPA技術建立了胡蘿卜種子中馬鈴薯斑紋片病菌的快速檢測方法及試劑盒，目標序列檢測低限可達到12.22拷貝／uL，對我國檢疫性病菌馬鈴薯斑紋片病菌的進出境檢驗檢疫工作有著一定的指導意義。趙玉梅基于致病疫霉Phytophthora infestans和芋疫霉P．colocasiae的三磷酸鳥苷結合蛋白基因序列Yptl成功建立了致病疫霉和芋疫霉的RPA-LFD檢測方法，在34℃條件下可以檢測到的最低核酸濃度均為1pg/uL。

本研究擬建立基于RPA擴增技術結合實時熒光和側流層析試紙條以實現結果可視化的梨火疫病菌快速檢測方法real-time RPA和RPA-LFD，為在田間采樣和試驗條件簡陋的現場檢測提供便捷準確的初步診斷方法，也期望為我國進出口植物檢疫部門提供技術支持。

1材料與方法

1.1供試菌株和培養基

本試驗供試梨火疫病菌菌株11株，包括：標準菌株DSMZ 50901和DSMZ 17948．從不同寄主上獲得的梨火疫菌株CAIQ 0591、CAIQ0592和CAIQ 0632等；亞洲梨火疫病菌E．Pyrifo-liae標準菌株DSMZ 12394、DSMZ 12162和非梨火疫菌的陰性對照菌株共12株；菌株信息詳見表1。NA培養基：23gnutrient agar，14g瓊脂粉，ddH201L。病原菌培養溫度為28℃。

1.2試劑和儀器

2×Taq PCR Master Mix、Gelred核酸染料（10000×）、50×TAE緩沖液、Biowest regularAGAR（）SE G-10，北京索萊寶科技有限公司；DNAMarker DL 2000，北京博邁德生物技術有限公司；Nutrient Agar、瓊脂粉，北京奧伯星生物技術有限責任公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；基礎型DNA恒溫快速擴增試劑盒、熒光型DNA恒溫快速擴增試劑盒、膠體金試紙條型DNA恒溫快速擴增試劑盒，安普未來生物科技有限公司。

Applied Biosystems PCR擴增儀，賽默飛世爾科技公司；DYY-11型瓊脂糖凝膠電泳儀，北京市六一儀器制造廠；全自動紫外凝膠成像系統，美國伯樂BIO-RAD公司；NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計、Roche Light Cycler 480Ⅱ型實時熒光定量PCR儀，上海羅氏診斷產品有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1供試菌懸液的制備和梯度稀釋濃度

將保存的菌株重新活化，制備菌懸液，吸取100uI。菌懸液加到無菌2.0mL離心管中，再加入900uLddH72混勻，依次稀釋10個梯度。吸取各梯度的菌懸液50uL涂布在NA培養基上，3次重復。28℃培養箱中倒置培養36～48h，取菌落數量在30～300之間的3個梯度平板進行計數，按平均值計算出菌懸液原液及各梯度菌懸液的濃度。

1.3.2DNA濃度測定

菌株DNA提取：按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，用NanoDrop 2000紫外分光光度計測量DNA濃度后，保存于-20℃備用。

植物DNA提取：疑似發病的梨枝葉置于研磨袋中，加入無菌水浸泡1h以上，吸取1.5mL浸泡液置于2.0mL離心管中，12000r/min離心5min，棄上清，留沉淀。按照北京天根生化科技有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書提取DNA，用NanoDrop 2000紫外分光光度計測量濃度后，保存于-20℃備用。

1.3.3引物和探針的設計

利用軟件Primer premier 5．0，針對梨火疫病菌的pEA29質粒（GenBank no．CP050241.1）、pEA71質粒（GenBank no.AF323724.1）、AMY1267基因（GenBank no.FR719190.1）以及16S-23S ITS區（GenBank no．AF449654.1）設計引物和探針（表2），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.4普通PCR擴增

PCR擴增體系為2×Taq PCR Master Mix12.5uL，上、下游引物（10mol/l。）各1uL，模板。反應程序為95℃預變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環；72℃延伸10min，4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，紫外凝膠成像儀觀察擴增產物條帶。

1.3.5重組酶聚合酶擴增RPA

將RPA擴增體系各組分：上、下游引物（10unol/L）各2.4uL、buffer A（水化緩沖液）29.5uL和ddH2O2.2uL預混；再加入裝有核酸外切酶、重組酶、聚合酶以及單鏈結合蛋白的凍干粉中，充分混勻；加入1uL模板和2.5uL buffer B（280 mmol/L醋酸鎂）后于金屬浴中39℃恒溫孵育20min，取5uL反應液做瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外凝膠成像儀觀察擴增產物條帶。

1.3.6實時熒光型重組酶聚合酶擴增（real-timeRPA）

以表1中的23個菌株的菌懸液和DNA進行re-al-time RPA。將real-time RPA擴增體系的組分：上、下游引物（10umol/L）各2uL、探針（10umol/L）0.6uL、buffer A（水化緩沖液）29.4uL和ddH2O11.5uL預混；再加入裝有核酸外切酶、重組酶、聚合酶以及單鏈結合蛋白的凍干粉中，充分混勻后加入模板和2.5uL buffer B（280mmol/L醋酸鎂），在實時熒光定量PCR儀中39℃恒溫擴增40個循環，每個循環30s，同時采集熒光信號，反應結束后觀察是否出現特異性擴增曲線。

梨火疫病菌菌株DSM 50901菌液經10倍比例稀釋后采用涂布法計數得到菌懸液原液濃度為的菌液進行real time-RPA擴增靈敏度檢測，菌株DSM 50901基因組DNA濃度為137.515ng/uL，10倍梯度稀釋后，進行real time-RPA擴增靈敏度檢測，每個濃度設置3個重復，最終確認real time-RPA檢測所需菌液濃度和DNA濃度的下限。

1.3.7側流層析試紙條型重組酶聚合酶擴增（RPA-LFD）

將RPA-LFD擴增體系的組分：上、下游引物（水化緩沖液）29.4uL和ddH2O 11.5uL預混后加入裝有核酸外切酶、重組酶、聚合酶以及單鏈結合蛋白的凍干粉中，充分混勻后再加入2uL模板和2.5uL buffer B（280 mmol/L醋酸鎂），在金屬浴中39℃孵育10min;反應結束后將未開蓋的反應管放于檢測裝置中，向下按壓裝置外殼直至閉合，室溫放置10min后觀察質控線和檢測線判讀結果。

以梨火疫病菌菌株DSM 50901菌液1.2×109～1.2×102 cfu/l。和基因組DNA為陽性對照組，其他菌株的新鮮菌液和所提取的DNA為陰性對照組，按照RPA-LFD擴增體系及反應程序驗證引物探針的特異性，以確認RPA-LFD檢測菌液和DNA的檢測下限。

2結果與分析

2.1引物對篩選

從11個梨火疫病菌菌株中隨機挑選3個菌株，從12個非梨火疫菌中挑選7個菌株，針對表2所列的6組引物D1～D6進行PCR。結果顯示，引物D2、D3、D5特異性差，引物D1（Ea365/Ea530）和D4（rRNA-F-288/rRNA-R-288）特異性好，可以用于后續試驗（表3）。

2.2real time-RPA的特異性

根據篩選出的引物對D1（Ea365/Ea530）和D4（rRNA-F-288/rRNA-R-288）設計了3條探針（A1～A3，見表2）。結果顯示：采用A2探針只有11株梨火疫病菌有擴增；采用A1和A3探針，雖然11個陽性菌株有明顯擴增，且Ct值在10左右，但亞洲梨火疫病菌DSMZ 12162和DSMZ 12394也有擴增；因此，本研究使用A2體系（D4引物+A2探針）完成后續研究。

2.3real time-RPA的靈敏度

用10倍梯度濃度為1.2×109～1.2×103 cfu/ml。的梨火疫病菌DSM 50901新鮮菌液為模板、D4引物對和A2探針的RPA擴增靈敏度測試結果顯示（表5），real time-RPA能檢測到菌液濃度的下限是1.2×106 cfu/mL，Ct值為19. 61。

以菌株DSM 50901的DNA（137.515ng/uL）經10倍梯度稀釋液為模板、利用D4引物對和A2探針進行real time-RPA能檢測到菌株DNA的下限是1.38×10-2 ng/mL，Ct值為16.99（表5）。

2.4RPA-LFD的特異性

利用RPA-LFD引物D4及探針B對表1中的23個菌株進行RPA-LFD特異性測試的結果表明：11株梨火疫菌株均為陽性，試紙條上質控線和檢測線顯示兩條線；12株非梨火疫菌株檢測結果均為陰性，試紙條上只顯示一條質控線（圖1），說明該體系檢測特異性較好。

2.5RPA-LFD的靈敏度

用10倍梯度濃度為1.2×109～1.2×102 cfu/mL的梨火疫病菌菌株DSM50901菌液對RPA-LFD體系的靈敏度測試結果顯示：RPA-LFD試紙條能檢測到的梨火疫菌液的濃度下限是104 cfu/mL（圖2）。

用10倍梯度稀釋的梨火疫病菌DSM50901基因組DNA對RPA-LFD體系靈敏度測試結果顯示：RPA-LFD試紙條能檢測到梨火疫病菌基因組DNA的濃度下限是1.38×10-3ng/uL（圖3）。

2.6植物樣品檢測

用6份梨火疫病枝葉樣品和健康梨枝葉樣品分別用無菌水浸泡2h后提取DNA，應用RPA-LFD試紙條檢測結果顯示：梨火疫病枝葉樣品檢測結果呈陽性，而健康梨枝葉樣品檢測結果為陰性（圖4）。

3結論

近年來，隨著農產品進出口貿易和國內物流的日益頻繁，梨火疫病傳播擴散的風險增加。本試驗建立了適合果園種植現場和簡易實驗室條件的靈敏快速且操作簡便的梨火疫病原菌檢測方法。實時熒光型RPA檢測方法和側流層析試紙條型RPA檢測方法均具有良好的特異性。利用梯度稀釋的梨火疫菌懸液作為模板進行測試發現兩類檢測方法靈敏度差異較大，試紙條型的靈敏度更高，最低檢測限為1.2×104 cfu/mL。利用梨火疫發病枝葉及健康梨枝葉樣品測試結果也驗證了RPA-LFD檢測結果的準確性。與實驗室常用的巢式PCR以及real-time PCR檢測效果相比，RPA試紙條型檢測方法同樣具有檢測靈敏度高、特異性強的特點。在實際應用中RPA試紙條型檢測方法不需要精密儀器、操作簡單，耗時短，結果肉眼可判，更易滿足基層簡易實驗室和現場初篩檢測的需求。