甘薯苗期黑斑病對(duì)薯苗生長(zhǎng)的影響及藥劑浸種對(duì)黑斑病的防治效果

關(guān)鍵詞甘薯；甘薯長(zhǎng)喙殼；甘薯苗期黑斑病；浸種；產(chǎn)苗量

甘薯是重要的糧食作物，也是營(yíng)養(yǎng)全面的健康食品，我國(guó)甘薯產(chǎn)量占世界總產(chǎn)的近60%。由甘薯長(zhǎng)喙殼Ceratocystis firnbriata Ellis et Halsted侵染引起的甘薯黑斑病是重要的甘薯病害。甘薯黑斑病在育苗期、生長(zhǎng)期和儲(chǔ)藏期均可發(fā)生，由該病造成的產(chǎn)量損失為5%～10%，甚至更高。育苗期發(fā)生黑斑病會(huì)影響薯苗的產(chǎn)量和質(zhì)量，病苗移栽到大田還可造成大田死苗和土壤帶菌，導(dǎo)致缺苗斷壟和病害進(jìn)一步蔓延。

我國(guó)于20世紀(jì)50年代開始研究甘薯苗期黑斑病的防治技術(shù)，主要措施包括種薯藥劑處理、溫湯浸種，以及頓水頓火育苗等；也有高剪苗和藥劑處理薯苗預(yù)防大田期甘薯黑斑病發(fā)生的報(bào)道。美國(guó)也通過(guò)藥劑處理種薯防治黑斑病等多種病害。隨著育苗技術(shù)發(fā)展和種植模式的變化，甘薯育苗主要由種苗生產(chǎn)企業(yè)和種植專業(yè)戶在溫室大棚等固定設(shè)施內(nèi)進(jìn)行，苗床的連年使用增加了苗床的帶菌量和黑斑病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，部分防治措施也已不適合當(dāng)前薯苗生產(chǎn)，甘薯苗期黑斑病的防控水平急需提高。

研究發(fā)現(xiàn)，育苗初期發(fā)生的甘薯黑斑病可導(dǎo)致幼芽變黑腐爛，但因從地表觀察不到幼芽破土前的發(fā)病癥狀，只能從出苗遲早、多少和薯苗顏色去推斷是否有黑斑病發(fā)生。以往研究均以成苗數(shù)量和成苗的發(fā)病率作為防控效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，未見(jiàn)對(duì)出芽、破土階段薯苗黑斑病的詳細(xì)調(diào)查和防控措施的效果評(píng)價(jià)。因此，從種薯出芽階段研究種薯或苗床帶菌對(duì)苗期黑斑病發(fā)生和薯苗生長(zhǎng)的影響，篩選有效的防控藥劑，對(duì)于提高黑斑病防控水平具有重要意義。

目前，在甘薯上登記的防治苗期黑斑病的藥劑較少。此前作者曾與拜耳有限責(zé)任公司合作開展試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種對(duì)苗期黑斑病有較明顯的防治效果。在此基礎(chǔ)上，本研究擬通過(guò)人工接種使種薯或育苗基質(zhì)攜帶黑斑病菌，再利用不同劑量藥劑處理，研究苗期黑斑病對(duì)薯塊出芽和薯苗生長(zhǎng)的影響，進(jìn)一步明確25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種對(duì)苗期黑斑病的防治效果，期望為甘薯苗期黑斑病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試甘薯品種及菌株：供試品種為‘商薯19’。甘薯長(zhǎng)喙殼由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離，菌株編號(hào)CFSC-01（CGMCC

No.3.18030），將菌株在PSA平板上25℃避光培養(yǎng)10d，無(wú)菌水洗下分生孢子，根據(jù)試驗(yàn)要求調(diào)節(jié)孢子懸浮液至合適的濃度，備用。

藥劑與試劑：試驗(yàn)藥劑25%肟菌·異菌脲懸浮劑（trifloxystrobin．iprodione 25% SC），拜耳有限責(zé)任公司；對(duì)照藥劑36%甲基硫菌靈懸浮劑（ thio-phanate-methyl 36% SC），江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司。Ezup柱式DNA抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；rTaq DNA聚合酶和DL2000 DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：Axio Scope. A1型正置顯微鏡，德國(guó)CarlZeiss公司；FYL-YS-280L恒溫箱，北京福意電器有限公司；96-Well Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)ThermoFisher公司；JY600HE電泳儀，北京君意東方儀器廠；Fresc0 17離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher公司；Alphalm-agernNi凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Protein Simple公司。

1.2方法

1.2.1苗床接菌及藥劑浸種試驗(yàn)

為初步評(píng)價(jià)25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種對(duì)甘薯苗期黑斑病的防治效果，2018年和2019年在育苗期進(jìn)行了試驗(yàn)。采取拱棚育苗，育苗小區(qū)為長(zhǎng)方形（1.1m×1m），四周用土埂與其他小區(qū)隔開，單獨(dú)灌水。25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種處理的藥液質(zhì)量濃度分別為250、333、500mg/L，36%甲基硫菌靈懸浮劑藥液質(zhì)量濃度500mg/L，另設(shè)清水對(duì)照處理。每處理4次重復(fù)，將薯塊在藥液中浸10min后取出晾干備用。人工接種在排種后隨灌水進(jìn)行，每小區(qū)使用孢子含量為1×106個(gè)/mL的甘薯黑斑病菌孢子懸浮液0.3L。浸種前稱量各小區(qū)種薯重，當(dāng)薯苗長(zhǎng)至5葉或株高達(dá)到25cm時(shí)達(dá)到成苗調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)，拔出小區(qū)內(nèi)所有符合標(biāo)準(zhǔn)的薯苗進(jìn)行病株率和成苗量調(diào)查，根據(jù)薯塊出苗先后共調(diào)查4次。

1.2.2種薯接菌及藥劑浸種試驗(yàn)

種薯接菌方法：使用孢子含量為5×105個(gè)/mL的甘薯黑斑病菌分生孢子懸浮液與潤(rùn)濕的蛭石和珍珠巖組成的接種載體混勻（接種載體與孢子懸浮液體積比6. 5：1），然后將大小均勻、無(wú)損傷的健康薯塊埋入接種載體，25℃保濕48h，獲得帶菌種薯，此時(shí)種薯外表無(wú)病斑顯現(xiàn)。

藥劑浸種及育苗方法：25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種的藥液質(zhì)量濃度分別為250、333mg/L和500mg/L，另設(shè)清水對(duì)照處理（CK1）和未接種甘薯黑斑病菌的健康種薯處理（CK2）。育苗在塑料筐（60cm×50cmX25cm）中進(jìn)行，育苗基質(zhì)為蛭石和草炭，體積比為3：1，每筐30塊種薯為一個(gè)重復(fù)，每處理重復(fù)3次，浸種前稱量各重復(fù)薯塊總重。將薯塊在藥液中浸10min，晾干后排種育苗。當(dāng)薯苗生長(zhǎng)至5～6片葉時(shí)達(dá)到成苗標(biāo)準(zhǔn)，拔出成苗進(jìn)行調(diào)查，統(tǒng)計(jì)每重復(fù)成苗數(shù)和病苗數(shù)，根據(jù)薯塊出苗先后共進(jìn)行4次薯苗調(diào)查。為觀察出芽和破土過(guò)程中發(fā)病對(duì)薯苗的影響，第1次調(diào)查時(shí)，每筐挖出10個(gè)薯塊，對(duì)薯塊上所有幼苗的發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，后3次調(diào)查只針對(duì)成苗。

1.2.3育苗基質(zhì)接菌及藥劑浸種試驗(yàn)

育苗基質(zhì)的配比同1.2.2，甘薯黑斑病菌孢子懸浮液濃度為2×105個(gè)/mL，每筐基質(zhì)與3L孢子懸浮液均勻混合，用于種薯育苗。種薯選擇、每重復(fù)薯塊數(shù)、浸種處理以及育苗和調(diào)查方法同1.2.2，同樣設(shè)清水對(duì)照（CK1）和健康薯塊在未接菌基質(zhì)中育苗的處理（CK2）。

1.2.4出芽和破土階段黑斑病發(fā)生情況調(diào)查及帶菌情況檢測(cè)

從筐中挖出薯塊時(shí)，觀察記載種薯發(fā)芽階段和薯苗不同生長(zhǎng)階段的發(fā)病情況。每處理3個(gè)重復(fù)共挖出30個(gè)薯塊，從中隨機(jī)抽取種薯帶菌和基質(zhì)帶菌試驗(yàn)CK1處理的15個(gè)薯塊，統(tǒng)計(jì)薯苗的發(fā)病部位；取每個(gè)重復(fù)顯癥薯苗和無(wú)癥薯苗各7株，取樣部位為顯癥薯苗的病斑部分和無(wú)癥薯苗的白色莖基部，利用PCR技術(shù)檢測(cè)帶菌情況。檢測(cè)方法如下，根據(jù)GenBank中登錄的甘薯長(zhǎng)喙殼甘薯分離物的Cera-to-platanin基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物：CFCPF417：5-gttctctatcctacccatgat-3;CFCPR417：5-gacgttgtcga-cacggccagct-3。截取取樣部位的莖段約1cm長(zhǎng)，在干凈研缽中加液氮充分研磨，使用Ezup柱式DNA抽提試劑盒提取樣品總DNA。20uL PCR反應(yīng)體系：rTaq預(yù)混酶1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用DPS18.10軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan氐新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1 25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種對(duì)苗床接菌后黑斑病的防治效果

苗床拔苗調(diào)查表明，25%肟菌·異菌脲懸浮劑250、333mg/L和500mg/L 3個(gè)處理的薯苗發(fā)病率隨藥液濃度的增加而降低，2018年分別為7.53%、3.33%和2.45%; 2019年分別為15.96%、13.01%和8.20%，中高濃度處理的發(fā)病率顯著低于空白對(duì)照，低于對(duì)照藥劑36%甲基硫菌靈SC處理。對(duì)應(yīng)的千克種薯產(chǎn)苗量隨藥液濃度的增加而增加，2018年分別為63.11、90.87株和126.92株，中高濃度處理顯著高于空白對(duì)照和對(duì)照藥劑處理；2019年分別為66.86、77.56株和85.31株，呈逐漸增加趨勢(shì)（表1）。由結(jié)果可知25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種薯，可有效防治苗期黑斑病的發(fā)生，增加產(chǎn)苗量。

2.2種薯接菌條件下25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種對(duì)薯苗黑斑病的防治效果

調(diào)查結(jié)果表明（表2），帶菌種薯育苗，所有處理的千克種薯出芽數(shù)在134.96～157.09株之間，處理間差異不顯著。藥劑浸種可減少萌發(fā)的幼芽發(fā)病，25%肟菌·異菌脲懸浮劑250、333mg/L和500mg/L處理的發(fā)病率在45.81%～47.34%之間，均顯著低于未藥劑浸種處理（CK1）的發(fā)病率。

采苗調(diào)查表明，健康種薯育苗（CK2）的千克種薯產(chǎn)苗量顯著高于其他處理，達(dá)到102.06株，未經(jīng)藥劑浸種的帶菌種薯育苗（CK1）的千克種薯產(chǎn)苗量最少，為57.10株，產(chǎn)苗量減少43.97%。帶菌種薯經(jīng)25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種處理的千克種薯產(chǎn)苗量隨藥液濃度的提高而增加，其中500mg/L處理的千克種薯產(chǎn)苗量為74.12株，顯著高于CK1處理。25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種的3個(gè)處理薯苗發(fā)病率在35.02%～39.69%之間，處理間差異不顯著，但均顯著低于CK1處理（表2）。調(diào)查結(jié)果表明，帶菌種薯育苗對(duì)出芽數(shù)量沒(méi)有明顯影響，但會(huì)引起萌發(fā)的幼芽和薯苗發(fā)病，顯著減少產(chǎn)苗量。

2.3育苗基質(zhì)接菌條件下25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種對(duì)薯苗黑班病的防治效果

調(diào)查結(jié)果表明（表3），育苗基質(zhì)帶菌時(shí)，所有處理的千克種薯出芽數(shù)在121.10～138.30株之間，處理間差異不顯著。25%肟菌·異菌脲懸浮劑250、333mg/L和500mg/L浸種處理的發(fā)病率在35.98%～40.46%之間，均顯著低于未經(jīng)藥劑浸種的清水對(duì)照（CK1），表明藥劑浸種薯可降低幼芽的發(fā)病率。

采苗調(diào)查表明，基質(zhì)未接菌的對(duì)照處理（CK2）千克種薯產(chǎn)苗量達(dá)到98.70株，顯著高于其他處理；種薯未經(jīng)藥劑浸種的對(duì)照（CK1）千克種薯產(chǎn)苗量最少，為39.66株，產(chǎn)苗減少59.82%。25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種的3個(gè)處理千克種薯產(chǎn)苗量隨藥液濃度的提高而增加，薯苗發(fā)病率明顯降低，其中500mg/L處理的千克種薯產(chǎn)苗量為69.56株，薯苗發(fā)病率為36.49%，與CK1差異顯著（表3）。說(shuō)明育苗基質(zhì)帶菌對(duì)種薯出芽數(shù)量沒(méi)有明顯影響，但會(huì)引起萌發(fā)的幼芽和薯苗發(fā)病，顯著減少產(chǎn)苗量。

2.4苗期黑斑病對(duì)薯苗生長(zhǎng)的影響

通過(guò)對(duì)正在出苗的薯塊進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明，種薯帶菌或育苗基質(zhì)帶菌引起的幼苗發(fā)病，在種薯萌芽初期，幼苗中上部易受侵染，受害部位縊縮（圖1a），病斑擴(kuò)大可造成頂芽或中上部枯萎壞死（圖1b），使幼苗生長(zhǎng)嚴(yán)重受限。幼苗中上部的發(fā)病率高于其他部位的發(fā)病率，種薯帶菌和基質(zhì)帶菌時(shí)幼苗中上部的發(fā)病率分別為40.88%和36.60%（表4）。幼苗中下部在生長(zhǎng)過(guò)程中，受侵染后會(huì)形成病斑（圖1c），隨著薯苗的生長(zhǎng)，發(fā)病部位的病斑會(huì)繼續(xù)發(fā)展（圖1d）。在幼苗破土過(guò)程中，可出現(xiàn)多部位同時(shí)受害的現(xiàn)象（圖1e），發(fā)病幼苗破土后表現(xiàn)出中上部枯萎的現(xiàn)象（圖1f），生長(zhǎng)基本停滯。隨育苗時(shí)間延長(zhǎng)，種薯也開始出現(xiàn)癥狀（圖1g），與薯塊相連接的薯苗莖基部受害現(xiàn)象開始增多（圖1h），隨癥狀加重部分薯苗形成典型的“黑腳”苗（圖1i），與健康薯苗（圖1j）相差很大。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，種薯帶菌和育苗基質(zhì)帶菌引起的薯苗發(fā)病過(guò)程和癥狀相同，均可引起幼苗中上部枯萎壞死，以及破土后中上部枯萎、生長(zhǎng)停滯，是造成產(chǎn)苗量減少的主要原因。

PCR檢測(cè)結(jié)果表明，種薯帶菌和基質(zhì)帶菌處理中顯癥薯苗樣品的黑斑病菌檢出率均為100%，無(wú)癥幼芽樣品的檢出率分別為85.71%和90.48%（表4），表明種薯帶菌和基質(zhì)帶菌均可引起薯苗和幼芽帶菌。

3結(jié)論與討論

本研究采用薯塊無(wú)損接種黑斑病菌技術(shù)，使甘薯種薯帶菌，通過(guò)灌水接菌和基質(zhì)接菌的方法使苗床帶菌。將薯塊出芽和薯苗破土過(guò)程中黑斑病的發(fā)生情況統(tǒng)計(jì)與產(chǎn)苗調(diào)查相結(jié)合，明確了種薯或苗床攜帶黑斑病菌對(duì)種薯出芽無(wú)明顯影響，但病原菌侵染會(huì)導(dǎo)致幼芽發(fā)病，引起薯苗死亡或生長(zhǎng)停滯，是產(chǎn)苗量減少的主要原因。甘薯幼苗破土前頂端或中上部易受黑斑病菌侵染，造成壞死枯萎，符合甘薯黑斑病可在育苗初期發(fā)生的論斷，與馬鈴薯晚疫病發(fā)生導(dǎo)致薯芽出土前腐爛，其幼芽的中部、頂端先受侵染的現(xiàn)象類似。明確甘薯苗期黑斑病的發(fā)病過(guò)程和引起產(chǎn)苗量減少的原因，有助于對(duì)甘薯黑斑病的精準(zhǔn)防控，提高甘薯黑斑病的防控效果。

肟菌酯有良好的內(nèi)吸性和向上傳導(dǎo)的特性，可抑制甘薯黑斑病菌生長(zhǎng)。異菌脲是保護(hù)性殺菌劑，已在甘薯儲(chǔ)藏期使用，也被證明施用于馬鈴薯種薯的幼芽時(shí)可在幼芽?jī)?nèi)傳導(dǎo)，能有效抵御病原菌侵染。在本研究中，不同帶菌情況下，使用25%肟菌·異菌脲懸浮劑浸種，成苗量均隨藥劑處理濃度的增加而增加，表明該藥劑能夠有效防控薯苗黑斑病，增加成苗量。目前我國(guó)僅登記有5種藥劑防治甘薯黑斑病．本試驗(yàn)的開展為25%肟菌·異菌脲懸浮劑在甘薯生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

25%肟菌·異菌脲懸浮劑不同濃度處理的幼芽發(fā)病率差異不明顯，可能與嫩芽易于被侵染且病害發(fā)展較快，不能進(jìn)行分級(jí)調(diào)查有關(guān)?；|(zhì)帶菌時(shí)，整個(gè)苗床病原菌分布均勻，可持續(xù)侵染薯苗；種薯帶菌時(shí)，菌源初期主要集中于薯塊周圍，隨著薯苗生長(zhǎng)，相對(duì)幼嫩的中上部組織會(huì)遠(yuǎn)離菌源集中區(qū)域。本次試驗(yàn)中基質(zhì)帶菌和種薯帶菌的成苗發(fā)病率隨藥劑濃度變化的趨勢(shì)不一致，反映出不同帶菌情況下藥劑對(duì)薯苗的保護(hù)效果有差別。

前人研究發(fā)現(xiàn)，秋季收獲的無(wú)黑斑薯塊表面粘附的黑斑病菌可侵染薯塊，但通過(guò)藥劑處理薯塊可獲得無(wú)病種薯。結(jié)合本研究明確的苗期黑斑病的發(fā)生特點(diǎn)和種薯、基質(zhì)帶菌對(duì)發(fā)病的影響，可將防治時(shí)期前移，嚴(yán)控甘薯種薯和苗床帶菌，加強(qiáng)種薯入窖前藥劑處理和苗床消毒是防治甘薯黑斑病的重要環(huán)節(jié)，因此有必要進(jìn)一步開展種薯和苗床處理藥劑的篩選和配套使用技術(shù)研究。