雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程細菌結構變化趨勢研究

摘要：【目的】為明確雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程中細菌結構動態變化趨勢。【方法】利用高通量測序技術測定了雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程細菌群落變化及其與環境因子的關系。【結果】基質中共有細菌物種OTU數目1 128個，包含26個門、66個綱、164個目、257個科、454個屬和687個種。細菌種群結構在發酵過程中發生顯著變化，發酵初始優勢細菌屬為尿素芽胞桿菌屬、芽胞桿菌屬、賴氨酸芽胞桿菌屬、拉梅爾芽胞桿菌屬及庫特氏菌屬，發酵末期優勢細菌屬則為norank_f__Limnochordaceae、氫孢菌屬、嗜熱雙孢菌屬和鹽孢菌屬。發酵中期和發酵末期細菌組成結構相似，與發酵前期呈顯著差異。冗余分析顯示發酵過程中細菌群落球形桿菌屬和特呂珀菌屬與氨氣濃度呈正相關，球形桿菌屬、熱多孢菌屬和norank_f_Steroidobacteraceae與發酵溫度呈正相關，而庫特氏菌屬與發酵溫度呈顯著負相關。【結論】基質經過二次發酵可有效降低了有害細菌的豐度，釋放氨氣濃度可作為二次發酵終點判斷指標之一。

關鍵詞：雙孢蘑菇；栽培基質；二次發酵；細菌多樣性

中圖分類號：S646.11" " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " "文章編號：2095-5774（2024）04-0260-11

Research on Trend of Microbial Structure Changes during the Secondary Fermentation

Process of Agaricus bisporus Cultivation Substrate

Chen Deju，Chen Meichun，Lan Jianglin，Wang Jieping*，Zhang Haifeng

（Institute of Resources，Environment and Soil Fertilizer，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350013，China）

Abstract：【Objective】 To clarify the effect of dynamic change of bacteria structure on substrate fermentation during the secondary fermentation process of Agaricus bisporus cultivation substrate. 【Method】The high-throughput sequencing technology was used to determine the changes in bacterial community during the secondary fermentation process of Agaricus bisporus cultivation substrate and its relationship with environmental factors. 【Result】A total of 1 128 bacterial operational taxonomic unit（OTU）were detected，including 26 phyla，66 classes，164 orders，257 families，454 genera，and 687 species. The bacterial species structure changed significantly during the fermentation process. At the initial stage of fermentation，the dominant bacterial genera are Ureibacillus，Bacillus.ssp，Lysinibacillus，Rummeliibacillus and Kurthia bacteria. At the end of fermentation，the dominant bacterial genera are norank_f_Lemnochordaceae，Hydrogenispora，Thermophilic Bacillus，and Salinispora. The bacterial species composition was relatively similar at the middle and late stages of fermentation，and was significantly distinguished from that before fermentation. Redundancy analysis showed that the bacterial community was a positive correlation between the genera of Staphylococcus and Truepera and NH3 concentration. The genera of Staphylococcus，Thermospora，and norank_f_Steroidobactereae were positively correlated with fermentation temperature，while the genusof Kurtosporawas significantly negatively correlated with fermentation temperature. 【Conclusion】After the secondary fermentation，the abundance of harmful bacteria effectively was reduced and NH3 emissions could be regard as the endpoint of fermentation in the substrate.

Key words：Agaricus bisporus；Cultivation substrate；Secondary fermentation；Bacterial diversity

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）屬傘菌目、傘菌科、蘑菇屬擔子菌門真菌［1］。因其口感鮮美、營養豐富，具有極高的食用品質和經濟價值，備受人們喜愛。除了食用價值外，雙孢蘑菇還是一種植物生物質降解真菌，在陸地生態系統中起著重要的碳循環作用［2］。雙孢蘑菇適宜溫暖潮濕的地區，在世界范圍內被廣泛栽培。我國是雙孢蘑菇生產第一大國，約占世界雙孢蘑菇總產量的50%以上［3］。雙孢蘑菇是一種好氣性的草腐性真菌，其栽培基質大都以價格低廉的農業秸稈廢棄物和畜牧糞便為原料來提供碳水化合物、蛋白質、無機鹽等菌菇必需的營養底物［4-5］，而這類農業廢棄物含有大量的纖維素、半纖維素、木質素等結構復雜且難以分解的物質，以及許多有害微生物，需要進行二次發酵腐熟消除有害微生物，并將培養料轉化為有利于菌菇吸收的營養物質后才能用于雙孢蘑菇的栽培［6］。

基質二次發酵是一個利用微生物將培養原料中各種化學物質分解轉化的自發熱過程，從而產生適宜雙孢蘑菇生長的營養環境基質。基質底物結構復雜，微生物需產生多種酶類物質對復雜底物進行協同利用，底物結構決定了微生物群落多樣性［6-7］。許多研究表明雙孢蘑菇栽培基質經過二次發酵后，優勢菌群主要為嗜熱細菌、真菌和放線菌，如Székely等［8］研究發現雙孢蘑菇栽培基質發酵過程中纖維素迅速降解與假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）、嗜熱放線菌（Thermobifida）和高溫單孢菌屬（Thermomonspora）有關；Zhang等［9］以小麥秸稈為原材料制備雙孢蘑菇栽培基質時，發現基質中占優勢群體的微生物為放線菌屬。雙孢蘑菇栽培基質發酵過程中添加有益細菌，能夠促進基質底物降解，提高蘑菇的產量，如Agnolucci等［10］在以橄欖加工廢料為主要原料的工廠化堆肥中添加Bacillus和Pseudomonas屬菌劑，提高了對原料的降解能力，促堆肥原料的充分利用，提高了蘑菇的產量；趙竹青等［11］利用不同原材料制備雙孢蘑菇栽培基質，發現基質經過二次發酵后，雙孢蘑菇產量與放線菌的豐度呈正相關；Coello-Castillo 等［12］研究發現雙孢蘑菇在含有嗜熱色串孢菌（Scytalidium thermophilum）定植的基質上生長更快，生物效率也得到極大提高。王琳等［13］對雙孢蘑菇二次發酵過程中細菌多樣性變化研究表明，培養料中主要有芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、桿菌屬、假單胞菌屬、Solibacillus、嗜熱裂孢菌屬、高溫雙歧菌屬和未知分類地位的不可培養細菌。何麗鴻等［14］在二次發酵剛開始和即將結束的雙孢蘑菇培養料中也分別檢測到了Thermus thermophilus，該菌能夠產生木聚糖降解酶參與半纖維素的降解。蔣寧等［15］在草菇的二次發酵培養料細菌多樣性研究中表明，在發酵期和出菇期厚壁菌的量均較多，尤其是芽孢桿菌類細菌是高溫發酵中非常重要的一類耐熱細菌，可以抵抗脫水和極端環境；發酵成熟的培養料中含有的大量放線菌。李輝平等［16］對草菇二次發酵料的微生物組研究表明，隨著草菇生長發育其生物群落在門水平上優勢菌群組成和豐度差異較大，厚壁菌門、放線菌門、子囊菌門、毛霉菌門是二次發酵后培養料的優勢菌。

栽培基質原料的復雜多樣，決定了基質微生物種群的多樣性，因此探明雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程微生物群落變化，對于二次發酵過程控制、選擇性培養出有利于雙孢蘑菇生長的微生物生態環境具有重要意義。本文將通過高通量測序分析雙孢蘑菇栽培基質發酵過程細菌群落結構變化及其與環境因子的關系，為深入了解細菌在基質過程中的作用及提高基質發酵效果提供支持。

1 材料與方法

1.1發酵基質原料

雙孢蘑菇栽培基質發酵原料由漳州角美鎮宏發公司提供，該原料為70%菇渣和30%牛糞一次發酵料，于2021年3月漳州市角美鎮農發公司雙孢蘑菇栽培基地進行二次發酵。

1.2 試劑與儀器

細菌DNA 抽提試劑盒（美國Omega 公司）；FastPfu Polymerase（北京全式金生物技術有限公司）；DNA凝膠回收純化試劑盒（PCR Clean-Up Kit，中國逾華）、ABI GeneAmp? 9700 型PCR儀（美國BIO-RAD公司）；JY600C電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司），馳誠電氣GC310復合式氣體檢測儀；Illumina PE300/PE250測序儀。

1.3方法

1.3.1雙孢蘑菇栽培二次發酵基質制備過程

發酵原料初始發酵溫度為45℃，發酵過程通風2～3次/ d，每次30 min，發酵過程持續14 d，每天測定堆料發酵溫度和氨氣濃度。分別于發酵初始（第0 d），發酵初期（第3 d）、發酵中期（第8 d）及發酵末期（第14 d）取樣200 g，樣品編號為Day0、Day3、Day8及Day14。

1.3.2雙孢蘑菇栽培二次發酵基質細菌宏基因組測序

利用E.Z.N.A.? soil DNA kit （Omega Bio-tek，

Norcross，GA，U.S.）說明書進行微生物群落總基因組DNA抽提，PCR擴增細菌16S rRNA基因V3-V4可變區基因，引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。PCR擴增后產物回收，依托上海美吉生物醫藥科技有限公司通過Illumina PE300/PE250平臺進行測序。測序完成后，基于上海美吉生物云平臺（https：//cloud.majorbio.com/）進行物種注釋、多樣性、冗余（RDA）等生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程中細菌物種數目變化

如圖1為雙孢蘑菇栽培基質一、二次發酵堆料及雙孢蘑菇栽培。為了研究二次發酵堆料中細菌動態變化與環境因子相關性，建立基質發酵釋放氨氣濃度與發酵終點相關性。采集二次發酵堆料初始期（圖1A），發酵初期、發酵中期和發酵末期（圖1B）樣本，分析微生物動態變化。雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程四個階段細菌物種分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）總數為1 128，包含26個門、66個綱、164個目、257個科、454個屬和687個種。利用Venn圖直觀觀察雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程四個階段的細菌物種OTU數目變化情況，如圖2所示，發酵初始、發酵初期、發酵中期和發酵末期的OTU數目分別為797、840、835和747個，四個階段共有的OTU數目為466個。

四個發酵階段的細菌物種在不同分類水平的數目變化如表1所示。在門、綱、目、科、屬和種水平，物種數目分別為21～26、47～63、124～146、193～216、322～354和476～529。從發酵初始到發酵末期，物種在門、綱、目和科水平數目增加，在屬和種水平數目下降。

2.2雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程中細菌多樣性分析

雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程中細菌Alpha多樣性統計結果見表2，樣本文庫覆蓋率（Coverage）均大于0.99，表明測序結果可靠，可真實反映二次發酵過程中細菌群落情況。Shannon和Simpson指數為微生物群落多樣性高低指標，Shannon越大，Simpson越小，細菌群落多樣性越高。雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程中Shannon和Simpson指數變化基本一致，細菌群落多樣性由高到低為發酵初期gt;發酵中期gt;發酵初始gt;發酵末期。發酵初期和中期細菌可以可利用底物比較多且溫度適合生存，因此物種較多，群落多樣性就比較高；隨著發酵溫度升高，嗜熱細菌繁殖，不耐高溫細菌減少，特別是發酵末期易分解有機質和可利用底物的減少，細菌群落多樣性降低［17］。Chao指數為細菌群落豐富度指數，在基質二次發酵過程中，Chao指數在發酵中期達到最高，表明此時基質中的細菌菌群豐富度最高，與此時可能含有最多的可利用底物相關。

2.3雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程中細菌組成變化

如表3所示，雙孢蘑菇栽培基質發酵過程中豐度較高的細菌群落包括尿素芽胞桿菌屬（Ureibacillus）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、賴氨酸芽胞桿菌屬（Lysinibacillus）、拉梅爾芽胞桿菌屬（Rummeliibacillus）、庫特氏菌屬（Kurthia）和norank_f__Limnochordaceae。發酵過程中，尿素芽胞桿菌屬、芽胞桿菌屬、拉梅爾芽胞桿菌屬和庫特氏菌屬細菌豐度隨著發酵時間增加，豐度逐漸下降，前期下降極為明顯。尿素芽胞桿菌屬、拉梅爾芽胞桿菌屬和芽孢桿菌屬是糞便堆肥中的常見微生物，具有降解木質素、纖維素等有機物的降解活性［18-19］，其在基質二次發酵初始豐度高，主要起到降解基質中各類有機質的作用，隨著各類有機質的降解，這類微生物的豐度也隨之降低。賴氨酸芽胞桿菌屬細菌豐度則隨著發酵的進行先上升后下降，于發酵初期含量達到最高，該屬菌株大都嗜鹽，具備礦化能力［20］。嗜熱雙孢菌屬豐度隨著發酵的進行，豐度逐漸增加，于發酵末期達到最高，該屬細菌對半纖維素有一定的降解能力［21］。嗜熱芽胞桿菌屬、氫孢菌屬、球形桿菌屬和熱多孢菌屬細菌豐度隨著發酵的進行，豐度先增加后下降，于發酵中期達到高峰。norank_f__Limnochordaceae屬細菌豐度逐漸增加，于發酵末期達到高峰，為末期所有細菌中豐度最高的屬。

庫特氏菌屬細菌能夠降解多環芳烴（PAH）和抗生素，可用于治理環境污染，但該屬菌株可能也會引起動物炎癥［22］。本文發現發酵初始基質中含有較高的庫特氏菌屬，隨著發酵的進行，該屬細菌豐度快速下降，到發酵末期未檢出該屬細菌，表明該基質經過二次發酵后，極大地降低了基質潛在的有害細菌。

進一步結合熱圖分析雙孢蘑菇栽培基質發酵過程中優勢細菌物種變化情況（圖3），直觀顯示了發酵過程的物種豐度情況，發酵初始優勢菌屬為尿素芽胞桿菌屬、芽胞桿菌屬、賴氨酸芽胞桿菌屬、拉梅爾芽胞桿菌屬及庫特氏菌屬，到發酵末期優勢菌屬則為norank_f__Limnochordaceae、氫孢菌屬、嗜熱雙孢菌屬和鹽孢菌屬。從圖3也可以看出，四個階段的樣品聚為三類，發酵中期和發酵末期聚為一類，其他的分別聚為一類，這表明基質發酵中期和末期，細菌物種組成保持穩定。

2.4雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程中細菌群落與環境因子相關性

對環境因子（發酵溫度和氨氣濃度）與發酵過程中細菌菌屬群落進行了Spearman相關性分析，結果如圖4所示。細菌群落中球形桿菌屬（Sphaerobacter）、特呂珀菌屬（Truepera）豐度與氨氣濃度呈顯著正相關（Plt;0.05），球形桿菌屬和熱多孢菌屬與發酵溫度呈極顯著正相關（Plt;0.01），norank_f_Steroidobacteraceae與發酵溫度呈顯著正相關（Plt;0.05）；Kurthia與發酵溫度呈顯著負相關（Plt;0.05）。

冗余分析（RDA）（圖5）顯示，氨氣濃度和溫度所代表的紅色箭頭連線都很長，表明這兩個環境因子與雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程中細菌群落的分布間相關性很大。氨氣濃度與發酵溫度之間夾角為銳角，表示二者之間呈正相關，發酵溫度越高，發酵過程釋放的氨氣濃度就越大，表明發酵的高溫課加速氨氣釋放，避免在雙孢蘑菇栽培中釋放較高的氨氣對菌絲體毒害作用［23］，因此可將釋放氨氣作為二次發酵終點判斷依據之一。進一步分析了細菌物種與環境因子的關系，結果顯示物種賴氨酸芽胞桿菌屬（Lysinibacillus）和norank_f_norank_o_SBR1031與2個環境因子的夾角均為銳角，說明這2類物種的豐度與環境因子呈正相關，發酵溫度越高，賴氨酸芽胞桿菌屬和norank_f_norank_o_SBR1031豐度越大；而尿素芽孢桿菌屬（Ureibacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和norank_f_Limnochordaceae與環境因子的夾角為鈍角，表明發酵溫度越高，它們的豐度越低。

3 結論與討論

雙孢蘑菇培栽培基質中的微生物主要細菌、放線菌和真菌三大類，在二次發酵初期，由于培養料中存在一些易降解的碳水化合物如果膠、寡糖等，使得一些競爭性的雜菌滋生。隨著堆料中微生物繁殖釋放熱量，嗜熱的微生物將這些易于降解利用的碳源消化利用，使得后續蘑菇菌絲在碳源的競爭上處于優勢地位。在發酵的不同階段，堆溫和物料的理化性狀不斷地發生變化，培養料中的細菌群落結構也在發生變化。

本文利用高通量測序技術對雙孢蘑菇栽培基質二次發酵過程四個階段細菌群落結構進行測定［24］。基質經過發酵后，優勢菌群從尿素芽胞桿菌屬、芽胞桿菌屬、賴氨酸芽胞桿菌屬、拉梅爾芽胞桿菌屬及庫特氏菌屬轉化為褐藻科norank屬、氫孢菌屬、嗜熱雙孢菌屬和鹽孢菌屬。王鴻磊等［25］研究表明培養料發酵過程中，在微生物的代謝轉化作用下，有機氮降解并以氨氣釋放到空氣中，使培養料散發刺鼻的氨味，但隨著發酵的進行，培養料中的有機物被微生物分解，使得培養料的質量和體積大幅減少，而氮元素的損失量遠遠小于培養料質量減少量，因此在發酵過程中培養料的含氮量表現為上升趨勢。探究了細菌群落組成與環境因子的關系，發現細菌群落中球形桿菌屬和特呂珀菌屬與氨氣濃度呈正相關，球形桿菌屬、熱多孢菌屬和黃色類固醇桿菌norank屬與發酵溫度呈正相關，而庫特氏菌屬與發酵溫度呈顯著負相關。基質經過發酵，致病菌豐度降低，研究結果為栽培基質二次發酵提供基礎數據支撐。

參考文獻：

［1］Vieira F R，Pecchia J A. Bacterial community patterns in the Agaricus bisporus cultivation system，from compost raw materials to mushroom caps［J］. Microbial Ecology，2022，84（1）：20-32.

［2］Pontes M V A，Patyshakuliyeva A，Post H，et al. The physiology of Agaricus bisporus in semi-commercial compost cultivation appears to be highly conserved among unrelated isolates［J］. Fungal Genetics and Biology，2018，112：12-20.

［3］Royse D J，Baarsj J P，Tan Q. Current overview of mushroom production in the world［M］Zied D C，Pardo-Gimenez A. Edible and medicinal mushrooms：Technology and applications. Chichester，UK：John Wiley amp; Sons Ltd. ，2017：5-13.

［4］Vos A M，Heijboer A，Boschker H T S，et al. Microbial biomass in compost during colonization of Agaricus bisporus ［J］. AMB Express，2017，7（1）：12.

［5］Zhang H L，Wei J K，Wang Q H，et al. Lignocellulose utilization and bacterial communities of millet straw based mushroom （Agaricus bisporus） production［J］. Scientific Reports，2019，9（1）：1151.

［6］張麗，盛斌，李常鳳，等. 雙孢蘑菇秸稈雞糞發酵技術研究進展［J］. 安徽農業科學，2021，49（1）：16-20.

［7］Jurak E，Kabel M A，Gruppen H. Carbohydrate composition of compost during composting and mycelium growth of Agaricus bisporus ［J］. Carbohydrate Polymers，2014，101：281-288.

［8］Székely A J，Sipos R，Berta B，et al. DGGE and T-RFLP analysis of bacterial succession during mushroom compost production and sequence-aided T-RFLP profile of mature compost［J］. Microbial Ecology，2009，57（3）：522-533.

［9］Zhang X，Zhong Y H，Yang S D，et al. Diversity and dynamics of the microbial community on decomposing wheat straw during mushroom compost production［J］. Bioresource Technology，2014，170：183-195.

［10］Agnolucci M，Cristani C，Battini F，et al. Microbially-enhanced composting of olive mill solid waste （wet husk）： Bacterial and fungal community dynamics at industrial pilot and farm level［J］. Bioresource Technology，2013，134：10-16.

［11］趙竹青，劉路，王秀蓮. 雙孢蘑菇培養料隧道式集中二次發酵試驗研究［J］. 中國果菜，2013，33（9）：3-5.

［12］Coello-Castillo M M，Sánchez J E，Royse D J. Production of Agaricus bisporus on substrates pre-colonized by Scytalidium thermophilum and supplemented at casing with protein-rich supplements［J］. Bioresource Technology，2009，100（19）：4488-4492.

［13］王琳，李敏，魏啟舜，等. 雙孢蘑菇培養料發酵過程中細菌群落結構分析［J］. 江蘇農業學報，2015，31（3）：653-658.

［14］何麗鴻，陳明杰，潘迎捷. 采用變性梯度凝膠電泳研究雙孢蘑菇培養料后發酵過程中的細菌群落結構［J］. 微生物學報，2009，49（2）：227-232.

［15］蔣寧，李輝平，林金盛，等. 草菇培養料發酵過程中細菌菌群的變化研究［J］. 湖北民族大學學報（自然科學版），2021，39（3）：261-265.

［16］李輝平，駱昕，馬林，等. 草菇栽培過程中培養料養分和微生物群落結構的動態特征［J］. 江蘇農業科學，2023，51（13）：149-157.

［17］Ren G M，Xu X H，Qu J J，et al. Evaluation of microbial population dynamics in the co-composting of cow manure and rice straw using high throughput sequencing analysis［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2016，32（6）： 101.

［18］傅海燕，曾光明，黃國和，等. 堆肥過程中產生生物表面活性劑的細菌的篩選［J］. 環境科學學報，2004，24（5）：936-938.

［19］劉建斌，武鳳霞，張淑彬，等. 高溫纖維素分解菌群PN-8的篩選及微生物組成研究［J］. 中國農學通報，2017，33（35）：50-56.

［20］曹丹. 土壤中微生物誘導碳固定技術的應用及其固碳途徑與分子機制研究［D］. 包頭：內蒙古科技大學，2023.

［21］Basotra N，Kaur B，Di Falco M，et al. Mycothermus thermophilus（Syn. Scytalidium thermophilum）：Repertoire of a diverse array of efficient cellulases and hemicellulases in the secretome revealed［J］. Bioresource Technology，2016，222：413-421.

［22］高云航，王曉青，趙化丹，等. 庫特氏菌屬細菌的研究進展［J］. 生物資源，2021（1）：26-33.

［23］徐松萍. 雙孢蘑菇二次發酵效益高［J］. 云南農業，2007（9）：24.

［24］Thai M，Safianowicz K，Bell T L，et al. Dynamics of microbial community and enzyme activities during preparation of Agaricus bisporus compost substrate［J］. ISME Communications，2022，2（1）：88.

［25］王鴻磊，王紅艷，宋俊芬，等. 雙孢菇培養料工廠化發酵過程中微生物及物質變化研究［J］. 安徽農業科學，2011，39（1）：94-96.

（責任編輯：許" " 玲）