兒茶素抑制p38 MAPK磷酸化減輕脂多糖誘導的大鼠心肌細胞凋亡、炎癥及氧化損傷

摘 要：為了研究兒茶素對脂多糖（LPS）誘導的大鼠心肌細胞（H9C2）氧化損傷、炎癥和凋亡的影響以及對p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的調控作用，本研究體外培養H9C2細胞，并將其分為對照組（不做干預處理）、LPS組（10 μg/mL LPS處理）、不同濃度兒茶素組（在LPS組基礎上以20、40、80、160 nmol/L兒茶素處理）、SB203580組（10 μg/mL LPS+1 μmol/L SB203580處理）、抑制劑組（10 μg/mL LPS+160 nmol/L兒茶素+1 μmol/L p38 MAPK通路抑制劑SB203580處理）和激活劑組（10 μg/mL LPS+160 nmol/L兒茶素+10 μmol/L p38 MAPK通路激活劑C16-PAF處理）。藥物干預處理24 h后，用細胞計數試劑盒-8（CCK-8）測定細胞活力；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測炎癥因子白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-10（IL-10）的含量；丙二醛（MDA）和超氧化物岐化酶（SOD）試劑盒檢測氧化應激因子MDA和SOD在細胞上清液中的表達水平；Hoechst 33258染色法測定細胞凋亡率；蛋白免疫印跡法測定天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和p38 MAPK通路相關蛋白表達水平。與對照組相比，LPS組細胞活力顯著降低（Plt;0.05）；與LPS組相比，添加160 nmol/L兒茶素后細胞活力顯著升高（Plt;0.05），最終選擇160 nmol/L兒茶素作為兒茶素組進行后續試驗。后續試驗中，與對照組相比，LPS組SOD、IL-10含量顯著降低（Plt;0.05），MDA、IL-6含量、細胞凋亡數、Caspase-3、p-p38 MAPK蛋白表達顯著升高（Plt;0.05）；與LPS組相比，兒茶素組和SB203580組顯著扭轉了上述指標的變化（Plt;0.05）；與兒茶素組相比，抑制劑組中的SB203580增強了上述指標的變化，而激活劑組中的C16-PAF則減弱了兒茶素對LPS誘導的H9C2細胞的作用（Plt;0.05）。本研究表明，兒茶素可顯著抑制LPS誘導的大鼠心肌H9C2細胞的凋亡、炎癥和氧化應激損傷，其作用機制或與抑制p38 MAPK通路的信號轉導相關。

關鍵詞：兒茶素；心肌細胞；脂多糖；p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路；氧化損傷

中圖分類號：R542.2" " " " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.03.009

Catechin Alleviates Apoptosis， Inflammation and Oxidative Damage of Rat Cardiomyocytes Induced by Lipopolysaccharide by Inhibiting p38 MAPK Phosphorylation

XING Jianhua*， SUN Lulu， LI Zhexian

（Department Geriatric Medicine， Hebei China Petroleum Central Hospital， Langfang 065000， China）

Abstract： To investigate the effects of catechins on oxidative damage， inflammation and apoptosis of rat cardiomyocytes （H9C2） induced by lipopolysaccharide （LPS）， as well as the regulation of p38 mitogen-activated protein kinase （MAPK） signaling pathway， H9C2 cells were cultured in vitro and divided into the control group which is without intervention， LPS group with 10 μg/mL LPS treatment， catechin with different concentrations （20， 40， 80， 160 nmol/L catechin treatment based on LPS group） and SB203580 group （10 μg/mL LPS+1 μmol/L SB203580 treatment）， inhibitor group （10 μg/mL LPS+160 nmol/L catechin +1 μmol/L p38 MAPK pathway inhibitor SB203580 treatment） and activator group （10 μg/mL LPS+160 nmol/L catechin +10 μmol/L p38 MAPK pathway activator C16-PAF）. Cell viability was measured with cell counting kit-8 （CCK-8） after 24 h treatment. The levels of interleukin-6 （IL-6） and interleukin-10 （IL-10） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） kits were used to detect the expression levels of oxidative stress factors MDA and SOD in cell supernatant. The apoptosis rate was determined by Hoechst 33258 staining. The expression levels of Caspase-3 and p38 MAPK pathway-related proteins were determined by Western blot. Compared with the control group， the cell viability of LPS group significantly decreased （Plt;0.05）. Compared with LPS group， the cell viability significantly increased after 160 nmol/L catechin supplementation （Plt;0.05）. Finally， 160 nmol/L catechin group was selected as catechin group for follow-up experiment. In the follow-up experiment， compared with the control group， SOD and IL-10 contents in LPS group significantly decreased （Plt;0.05）， MDA and IL-6 contents， apoptosis number， Caspase-3 and P-P38 MAPK protein expression significantly increased （Plt;0.05）; compared with LPS group， catechin group and SB203580 group significantly reversed the changes of the above indexes （Plt;0.05）; compared with the catechin group， SB203580 in the inhibitor group enhanced the changes in the above indicators， while C16-PAF in the activator group attenuated the effect of catechin on LPS-induced H9C2 cells （Plt;0.05）. In this study， catechins can significantly inhibit the apoptosis， inflammation and oxidative stress injury of H9C2 cells induced by LPS， and the mechanism of action may be related to the inhibition of p38 MAPK pathway signal transduction.

Key words： catechins; cardiomyocytes; lipopolysaccharide; p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway; oxidative damage

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（3）： 259-266）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）易造成殘疾，嚴重者會發生猝死，其具有發病率和死亡率高的特點，嚴重危及人體健康［1］。心力衰竭屬于臨床常見的心血管疾病，作為一種多因素導致的全身性疾病，臨床心血管疾病的治療藥物較多，如利尿劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、β受體阻滯劑和藥物洋地黃等，但均有副作用。因此，尋找新的治療藥物是目前研究的熱點之一。中醫學認為，心衰總病機是“氣虛血瘀水停”，心力衰竭治療總原則應以益氣活血利水為法。兒茶素是茶葉中含量豐富的一類生物活性物質，其藥理活性已引起廣泛的研究關注［2-3］。已有研究表明，兒茶素可顯著減弱小鼠小膠質細胞炎癥和神經毒性［4］，也能通過調節Toll樣受體2和炎癥小體信號轉導減輕牙齦卟啉單胞菌引起的炎癥［5］。不止炎癥，氧化應激也屬于心力衰竭綜合征潛在的關鍵生理因素。研究發現，心肌細胞氧化應激可導致心臟基質細胞的衰老［6］。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）是一種與細胞凋亡和炎癥反應等密切相關的通路蛋白酶，且可被一些刺激（如氧化應激和炎癥損傷）激活，導致心肌損傷，但抑制p38 MAPK的激活則可緩解心肌損傷［7］。兒茶素是否能通過p38 MAPK信號通路對凋亡、炎癥及氧化損傷進行調節尚未可知。內毒素脂多糖（lipolyaccharide，LPS）可刺激許多促炎標記物，從而觸發多種免疫級聯反應［8-9］。基于此，本研究探討兒茶素干預對LPS誘導的心肌細胞凋亡、炎癥及氧化壓力的影響以及對p38 MAPK信號通路的調控機制，為心肌損傷治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

大鼠（Rattus norvegicus）心肌細胞（H9C2）購自河南省工業微生物菌種工程技術研究中心。

1.1.2 藥品與試劑

兒茶素（純度≥96%）、LPS、p38 MAPK通路抑制劑SB203580（純度≥98%）（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為B20850、S80391、S11060）；p38 MAPK通路激活劑C16-PAF（santaCruz，批號為L2098，純度≥98%），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco-美國，批號為10270-106），活細胞計數試劑盒-8（counting kit-8，CCK-8）（諾唯贊-南京，批號為A311-02），RIPA裂解液（上海碧云天生物技術股份有限公司，批號分別為S0101S、S0131S、P0013B），人可溶性白細胞介素-6（soluble interleukin-6，sIL-6）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent，ELISA）試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號分別為ml038115、ml064299）；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術股份有限公司，批號分別為S0101S、S0131S、P0013B），兔抗鼠［半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate protease，Caspase-3）、p38 MAPK和p-p38 MAPK及β-actin一抗］、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（二抗）（武漢三鷹生物技術有限公司，批號分別為10021291、10004552、287961AP、10021787、20000373）。

1.1.3 儀器

Multiskan FC型酶標儀（ThermoFisher Scientific，美國）；BPN-40RHP型二氧化碳培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；DXS_3型倒置熒光顯微鏡（上海締倫光學儀器有限公司）；DYCZ-24KF型四板垂直蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 H9C2細胞培養

H9C2細胞在37℃、5% CO2培養箱中培養，培養于Dulbecco改良Eagle培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）（含10% FBS），細胞貼壁（密度達70%～80%）后進行傳代，取處于對數生長期的心肌細胞用于試驗（對數生長期）。

1.2.2 分組與干預

選取對數期生長的H9C2細胞，將其分為對照組、LPS組、不同濃度兒茶素組、SB203580組、抑制劑組和激活劑組。對照組（不做干預），LPS組構建體外炎癥模型（10 μg/mL LPS刺激24 h）［10］；不同濃度兒茶素在LPS組基礎上加入20、40、80、160 nmol/L兒茶素；經CCK-8篩選出合適的濃度（160 nmol/L兒茶素）作為兒茶素組進行后續試驗；SB203580組在LPS組的基礎上加入1 μmol/L p38 MAPK通路抑制劑SB203580［11］；抑制劑組在LPS組的基礎上，加入160 nmol/L兒茶素，同時加入1 μmol/L SB203580，激活劑組在LPS組的基礎上，加入160 nmol/L兒茶素，同時加入10 μmol/L p38 MAPK通路激活劑C16-PAF［12］處理。每組設置3個復孔，置于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h。

1.2.3 觀察指標

1.2.3.1 CCK-8法測定H9C2細胞活力

各組細胞加10 μL CCK-8溶液培養2 h，用酶標儀測450 nm處各孔光密度（optical density，OD）值后計算細胞活力。細胞活力為各組（LPS組或不同濃度兒茶素組）OD值占對照組OD值的百分比。

1.2.3.2 ELISA法測定H9C2細胞因子表達情況

各組細胞上清液采用IL-6和IL-10、MDA和SOD試劑盒說明書操作步驟，測定細胞因子IL-6、IL-10、MDA和SOD的表達情況。

1.2.3.3 Hochest 33258染色法測定H9C2細胞的凋亡情況

取各組細胞用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2次，每次5 min，4%多聚甲醛4℃固定10 min。PBS洗滌3次，每次5 min，染色液（5 mg/L，Hoechst 33258）染色10 min，PBS洗滌（3次，每次5 min）后封固。熒光顯微鏡隨機拍照（3個視野）。采用ImageJ進行細胞計數。細胞凋亡特征：呈亮藍色，核體積變小、濃縮，不均濃染，熒光較強。細胞凋亡率即為凋亡細胞數占總細胞數的百分比。

1.2.3.4 蛋白免疫印跡（Western blot，WB）法檢測H9C2細胞中Caspase-3與p38 MAPK信號通路相關蛋白的表達水平

收集藥物干預24 h的細胞，在冰上裂解（RIPA液），提取蛋白并定量后上樣，跑電泳后轉膜，封閉2 h，參照抗體說明書加入相應一抗（p38 MAPK、p-p38 MAPK、Caspase-3及β-actin），4℃孵育過夜，洗膜緩沖液（tris buffered saline tween，TBST）洗滌后加入山羊抗鼠IgG二抗，孵育2 h，洗滌3次，最后加入顯影液，利用凝膠成像系統拍照記錄。目的蛋白灰度值比內參蛋白灰度值（β-actin）即為相對表達量。

1.3 統計學分析

使用的統計分析軟件為SPSS 26.0。符合正態分布的計量資料表示方式為平均值±標準差（x±s）。多組間比較利用單因素方差分析，兩組間比較采用Dunnett’s t檢驗。Plt;0.05即為有顯著差異。利用GraphPad Prism 8軟件進行制圖。

2 結果與分析

2.1 兒茶素對LPS誘導H9C2細胞活力的影響

如圖1所示，LPS組細胞活力較對照組下降（Plt;0.05），160 nmol/L兒茶素細胞活力較LPS組顯著升高（Plt;0.05），其余濃度兒茶素無顯著性差異（Pgt;0.05）。所以，選擇160 nmol/L兒茶素作為兒茶素組加入p38 MAPK信號通路抑制劑SB203580和通路激活劑C16-PAF進行p38 MAPK通路驗證試驗。

2.2 兒茶素通過調控p38 MAPK通路活性對LPS誘導H9C2細胞炎癥因子表達的影響

如圖2所示：LPS組細胞炎癥因子IL-6表達水平較對照組上升（Plt;0.05），IL-10表達水平降低（Plt;0.05）；兒茶素組和SB203580組細胞炎癥因子IL-6含量較LPS組下降（Plt;0.05），IL-10含量上升（Plt;0.05）；抑制劑組細胞IL-10含量較兒茶素組上升（Plt;0.05），IL-6含量顯著下降（Plt;0.05）；激活劑組IL-6含量上升（Plt;0.05），IL-10含量下降（Plt;0.05）。

2.3 兒茶素通過調控p38 MAPK通路活性對LPS誘導H9C2細胞氧化壓力的影響

如圖3所示：LPS組細胞SOD含量較對照組下降（Plt;0.05），MDA含量顯著升高（Plt;0.05）；與LPS組比較，兒茶素組和SB203580組細胞SOD含量顯著升高（Plt;0.05），MDA含量下降（Plt;0.05）；與兒茶素組相比，抑制劑組細胞SOD含量上升（Plt;0.05），MDA含量下降（Plt;0.05），激活劑組MDA含量顯著升高（Plt;0.05），SOD含量顯著降低（Plt;0.05）。

2.4 各組H9C2細胞凋亡能力的比較

如圖4所示：對照組細胞大小均勻，輪廓清晰，細胞核彌散均勻呈淡藍色，而其他各試驗組細胞核染色不均，體積濃縮變小，呈亮藍色、熒光較強等典型細胞凋亡特征；LPS組細胞凋亡率較對照組增加（Plt;0.05）；兒茶素組和SB203580組細胞凋亡率較LPS組減少（Plt;0.05）；抑制劑組細胞凋亡率較兒茶素組減少（Plt;0.05），激活劑組細胞凋亡率增加（Plt;0.05）。

2.5 兒茶素通過阻遏p38 MAPK通路活性對LPS誘導H9C2細胞Caspase-3及p38 MAPK通路蛋白表達的影響

如圖5所示：LPS組Caspase-3、p-p38 MAPK蛋白水平較對照組升高（Plt;0.05）；兒茶素組和SB203580組Caspase-3、p-p38 MAPK蛋白水平較LPS組下降（Plt;0.05）；抑制劑組Caspase-3、p-p38 MAPK蛋白水平較兒茶素組下降（Plt;0.05），激活劑組Caspase-3、p-p38 MAPK蛋白水平較兒茶素組升高（Plt;0.05）。

3 討論

心力衰竭是常見的心血管疾病，發病率高，威脅人類健康。抗心力衰竭藥物很多，但現有藥物有較明顯的副作用，未顯著提升患者的生活質量和壽命，增加了國家醫療支出，給患者家庭和社會造成了巨大的負擔及經濟壓力［13］。因此，尋找新的高效且副作用小的治療藥物尤為重要。研究發現，自然界中的許多植物及天然產物都具有抗心衰功能。類黃酮化合物為植物的次生代謝產物，在植物界分布較廣，有較強的生物活性。兒茶素是主要的類黃酮化合物之一。近年發現，兒茶素及其類似化合物具有抗氧化、保護心血管、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調節、神經保護、調節糖脂代謝等藥理作用［14］。特別是在心血管系統方面，兒茶素可減弱心臟缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷，增加心肌存活率，減少心肌凋亡［15］。有研究證實，兒茶素對心臟有抗氧化應激作用，還具備抗缺氧、抗心肌I/R損傷、抑制心肌細胞凋亡等作用［16］。另有研究表明，兒茶素可通過誘導抗凋亡蛋白的表達，抑制促凋亡蛋白水平，進而抑制心力衰竭，起到心臟保護作用［17］。張文強等［18］分析了兒茶素對心肌缺氧/復氧損傷的保護作用，發現兒茶素增加了缺氧/復氧損傷下心肌細胞的活力。以上研究表明，兒茶素對心肌細胞有廣泛的保護作用。本研究發現，LPS誘導大鼠心肌H9C2細胞后，促炎因子IL-6表達水平顯著升高，抑炎因子IL-10表達水平顯著降低，細胞活力顯著降低，提示LPS誘導大鼠心肌損傷細胞模型構建成功。加入20、40、80、160 nmol/L兒茶素后，IL-6水平下降，IL-10水平上升；加入LPS，同時加入160 nmol/L兒茶素后細胞活力增加。這提示160 nmol/L兒茶素可抑制LPS誘導的H9C2細胞炎癥，提高細胞活力，最終選擇160 nmol/L兒茶素進行后續通路驗證試驗。

研究表明，MAPK在I/R損傷的心肌細胞中被異常激活［19］。p38 MAPK作為MAPK家族中的一個成員，活性氧可將其激活，導致線粒體內活性氧水平上升，損傷線粒體［20］。有報道指出，抑制p38 MAPK信號通路激活可緩解I/R所致的小鼠心肌損傷［21］。本研究結果表明，LPS誘導大鼠H9C2心肌細胞損傷后，細胞凋亡率、氧化應激因子MDA表達水平、細胞凋亡相關蛋白Caspase-3表達及p38 MAPK磷酸化水平均顯著升高，抗氧化應激因子SOD表達水平顯著降低。加入兒茶素后，細胞凋亡率、MDA表達水平、Caspase-3蛋白表達和p38 MAPK磷酸化表達顯著降低，SOD表達水平顯著升高。這提示，兒茶素對心肌細胞H9C2的凋亡與氧化損傷的作用機制可能與p38 MAPK信號通路有關。在兒茶素組的基礎上分別加入p38 MAPK信號通路的抑制劑SB203580后，細胞凋亡率、MDA表達水平、Caspase-3蛋白及p38 MAPK磷酸化表達顯著降低，SOD表達水平顯著升高，而加入p38 MAPK信號通路激活劑C16-PAF則顯著扭轉了上述指標，表明兒茶素可抑制LPS誘導的心肌H9C2細胞凋亡、炎癥、氧化應激，且可能是通過負調控p38 MAPK信號通路發揮作用。

綜上所述，兒茶素能夠通過阻遏p38 MAPK信號通路抑制大鼠心肌H9C2細胞凋亡，發揮對氧化應激和炎癥損傷的保護作用。本研究能夠為兒茶素通過調控p38 MAPK信號通路對心力衰竭的治療提供理論支持，但不足的是，兒茶素在心力衰竭中是否存在其他信號通路的調控機制等，仍需要進行進一步研究。

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