水產養殖病害快速檢測技術研究※

●錢詩悅 曹 梅※※ 王興強 李佳陽 朱碧瑩 李 永 葉建生

（1.江蘇海洋大學海洋科學與水產學院 江蘇 連云港 222006；2.連云港僑海漁業科技有限公司 江蘇 連云港 222045；3.江蘇農牧科技職業學院水產科技學院 江蘇 泰州 225300）

水產品是人類食物的重要組成部分。水產品的營養價值極為豐富[1]，其為人類提供的蛋白質超過人體動物蛋白質攝取總量的50%[2]。目前我國水產養殖面積超700萬公頃[3]。但當前水產養殖也存在各種各樣的問題，如養殖空間不足，養殖品種單一，養殖病害頻發等。缺乏養殖空間使人們將目光投向高密度水產養殖，高密度水產養殖加大了病害防治的難度。目前水產養殖病原快速檢測技術主要有兩大類：免疫學檢測技術和分子生物學檢測技術。

1 免疫學檢測技術

免疫學檢測技術的原理是抗原抗體的特異性反應，也被稱為血清學反應[4]，可對免疫相關的各種細胞進行特定分析。該技術在水產養殖病原檢測領域有著廣泛的應用。

20世紀中后期，K?hler和Milstein發現并創立了單克隆抗體技術，對生物醫學產生了劃時代的影響[5]。單克隆抗體技術現可用于檢測水生動物病毒性疾病﹑細菌性疾病以及寄生蟲病[6]。因為單克隆抗體檢測病毒存在一些困難，所以多結合免疫酶聯吸附試驗技術（ELISA）和免疫熒光技術等進行。黃倢等[7]應用單克隆抗體的ELISA技術檢測暴發性皮下造血組織壞死病（Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Baculo Virus，HHNBV），結合相應的單抗對山東﹑遼寧等地的蝦池樣品進行檢測，結果顯示，蝦池的發病情況與檢測陽性結果基本相符，少數存在差異，已發病的蝦池檢測出陰性結果說明發病的蝦池中也有未感染病毒的對蝦，而未發病的蝦池檢測出陽性結果說明病原已進入蝦池，這符合流行病學規律。Lapatra等[8]研發采用單克隆熒光抗體試驗檢測魚類傳染性造血器官壞死病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV），通過對待測樣品的脂肪進行檢測得出結果。熒光抗體技術在特異性﹑靈敏度﹑檢測速度等方面都具有一定的優勢，但是該技術的儀器價格高且功能不豐富，操作起來步驟多，無法進行非特異性染色，染色標本有效期短。

查智輝[9]研究采用間接熒光抗體方法檢測三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的血卵渦鞭蟲（Hematodinium），能夠有效檢測出血卵渦鞭蟲陽性。辛志明[10]等利用從發病的日本鰻鱺（Anguilla japonica）肝臟中分離的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）制備單克隆抗體，該方法操作簡單﹑檢測時間短，適合基層生產一線臨床檢測。

免疫學檢測技術在病原檢測方面的應用相較于分子生物學優勢并不明顯，因為免疫學檢測技術的成本相對較高，且操作復雜。免疫學技術的優勢體現在對免疫缺陷病﹑超敏反應﹑移植排斥反應﹑腫瘤等人類疾病的檢測，免疫分子的定性定量測定，抗原物質的定性﹑定量檢測，T細胞及其亞群免疫細胞的分離﹑鑒定及功能測定，這些比水生動物病原檢測的要求更高[11-12]。但是相較于分子生物學檢測技術，免疫學技術在速度和成本上就稍遜一籌。

2 分子生物學檢測技術

隨著分子生物學的發展，其在各個領域有了廣泛的應用，尤其在檢測方面的應用相當豐富。分子生物學檢測技術通過對病原體的核酸進行精準的識別匹配來進行檢測[13-16]。最早出現的分子生物學檢測技術是核酸雜交技術，后衍生出基因芯片技術，如今分子生物學檢測技術主要有兩個路徑，即PCR擴增技術和環介導等溫擴增技術。

2.1 核酸雜交技術

核酸雜交技術根據檢測樣品的不同可分為DNA印跡雜交和RNA印雜交，核酸雜交技術在1961年問世，在特定反應體系中放入探針和靶序列進行反應，通過梯度離心獲得對應產物，這種方法速度較慢，步驟多且結果不夠精確。1962年Bolton等設計出固相雜交方法，探針是做了特殊標記的DNA或RNA序列，與病原體核酸中互補的靶核苷酸進行雜交，以檢測核酸樣品中的特定基因序列。呂玲等[15]建立了檢測白斑綜合癥病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）的原位雜交方法，采用原位雜交檢測的方法對對蝦的各個部位進行檢測，原位雜交結果均為陽性；研究結果表明，短探針敏感性較高，長探針敏感性降低，探針過長會使結果產生偏差。

核酸雜交技術目前還存在一些問題，每檢測一種病原體都要制備一種核酸探針，樣品的制備步驟復雜且耗時長，對樣品的要求高，樣品的純度﹑目標基因的濃度﹑雜質含量等都會影響探針的檢測結果，相較于其他檢測方法，檢測的速度﹑敏感性都會成為劣勢。

2.2 基因芯片技術

基因芯片又叫DNA芯片﹑生物芯片技術就是核酸技術衍生出的新技術，基因芯片技術是將大量探針分子固定到玻璃片﹑硅片﹑聚乙烯膜等支持物上，樣品分子進行標記之后與支持物上的探針分子進行反應，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度而獲取反應結果。基因芯片技術的操作步驟是在一塊基片表面固定想要測定的各種已知序列的靶核苷酸的探針，將待測樣本中的mRNA提取后，通過反轉錄反應過程獲得標記熒光的核酸序列，然后與基片上的探針進行雜交反應，再將基片上未進行互補結合反應的片段洗去，對基片進行激光共聚焦掃描，測定芯片上的各點的熒光強度來推算待測樣品中的各種基因的表達量。Stanford School of Medicine的cDNA芯片和Affymetrix公司的寡核苷酸芯片是目前最常用的兩種芯片。基因芯片的應用非常廣泛，可用作疾病的診斷和治療，藥物篩選﹑農作物的優育優選﹑司法鑒定﹑食品衛生監督﹑環境監測等，該技術在藥物及基因篩查等涉及人類生命健康的應用上時品質要求非常高，技術難度也相當大，但是將基因芯片技術應用到水生動物病原檢測中則可以降低標準，使其成本，效率能夠契合水產動物病原檢測要求即可。

宋居易等[16]將多重PCR單鏈擴增技術和基因芯片技術相結合，建立了南美白對蝦4種病原體可視化快速檢測檢測方法，其中包括對蝦急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌﹑對蝦白斑綜合征病毒﹑對蝦傳染性皮下造血組織壞死病毒﹑對蝦肝腸孢蟲，該方法將基因芯片技術進行改進簡化，多重PCR單鏈擴增技術與獨特的生物芯片技術結合，成本降低，檢測指標多，速度快，靈敏度高，該技術還將熒光標記改換成生物素與標記有磷酸脂酶的鏈酶親和素結合可在底物顯色液作用下顯色，從而達到可視化目的。

基因芯片技術雖然較為復雜，但其應用范圍非常廣，可根據需要進行優化，值得進行更多的研究。

2.3 PCR擴增技術

PCR擴增技術是分子生物學中發展最快﹑應用最廣泛的技術，其可分為常規PCR技術﹑巢式PCR技術﹑熒光定量PCR技術﹑原位PCR技術等。

2.3.1 常規PCR技術常規聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術主要通過體外的酶促合成產物特異性的DNA片段，產物通過電泳出現條帶則代表結果為陽性，電泳后未出現條帶則表示結果為陰性。JEE Y L等[17]采用常規PCR技術對創傷弧菌進行鑒定；Beaz H R等[18]采用常規PCR技術檢測鮭魚殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida），該方法是以黏液為靶組織的無損檢測方法，對于感染魚體和無癥狀攜帶魚體都能夠進行特異﹑靈敏﹑快速的檢測。彭宣憲等[19]以細菌通用16 s保守區特異性引物，以大腸桿菌和雙歧桿菌為參照，建立起可以檢測出嗜水氣單胞菌﹑柱狀曲橈桿菌（cytophaga columnaris）等6種常見魚病病原菌的檢測技術，該方法也是依托于常規PCR技術。

常規PCR技術與免疫學方法相比，特異性和靈敏度都大大提高，缺點在于常規PCR技術中引物的非特異性擴增會導致的假陽性﹑假陰性結果，該技術還不能獲得定量結果。所以常規PCR技術與其他新型的PCR技術相比存在較大劣勢。

2.3.2 巢式PCR巢式PCR是設計兩對引物對目的基因進行擴增，其優勢在于可以增加反應的特異性。李文杰等[20]根據Genbank中已發表的白斑綜合癥病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）VP28基因序列設計相應的巢式PCR引物，建立的檢測克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）WSSV的巢式PCR方法，試驗證明，巢式PCR方法的靈敏度是普通一步PCR方法的1000倍，檢測限達到36 pg；樊曉琳[21]建立了巢式PCR方法，可以快速檢測副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），可在4 h內完成樣本檢測，節約培養菌的時間；謝亞君等[22]對比了普通PCR﹑雙重PCR﹑巢式PCR﹑熒光定量PCR以及環介導等溫擴增五種方式檢測Ⅱ型鯉皰疹病毒的靈敏度和陽性檢出率，發現熒光定量PCR和巢式PCR的靈敏度和陽性檢出率最高，普通PCR和雙重PCR靈敏度相對低一些。羅明菊等[23]為了預防大口黑鱸（Micropterus salmoides）雙RNA病毒建立了巢式RT-PCR檢測方法，試驗中發現第二輪擴增靈敏度比第一輪擴增高10000倍，該方法的特異性也相當高，對大口黑鱸雙RNA病毒預防和早期檢測非常有利。

2.3.3 實時熒光定量PCR技術實時熒光定量PCR技術是一種可以對目標模板進行定量分析的一種PCR技術，該技術通過在PCR反應體系中加入熒光基團，在PCR反應過程中對熒光信號進行實時檢測，最后通過標準曲線分析得出定量結果，實時熒光定量PCR有SYBRGreen Ⅰ法和Taqman探針法兩種檢測方法[24-25]。榮小軍[26]建立了遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda，E.tarda）的SYBR Green Ⅰ實時定量PCR檢測方法，靈敏度高，定量準確。SYBR Green Ⅰ實時定量法相較Taq Man探針法，操作更簡單，價格較低，不需要設計探針，只需要在反應混合液中加入引物和待測樣品的DNA，該方法對人工感染的大菱鲆病樣進行檢測展現了較好的實用性。李惠芳等[27]建立了檢測斑點叉尾鮰病毒株（Channel Catfish Virus，CCV）的熒光定量PCR檢測方法，根據Genbank設計引物和TaqMan熒光探針，可在3 h內檢測出結果；安偉等[28]建立檢測鯉春病毒血癥病毒（Spring Viraemia of Carp Virus，SVCV）的SYBR Green Ⅰ熒光定量RT-PCR方法，該方法特異性強﹑靈敏度好﹑重復性好，還降低了實驗成本。

熒光定量RT-PCR技術優點非常多，反應的全封閉性，自動化程度高，不需要電泳所以毒性較小，整個過程非常不超過3 h，且同一批次可檢測多個樣品，但是要注意樣本間的互相污染問題。

2.4 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）的特點是該技術是在等溫條件下進行的擴增反應，利用4條引物在雙鏈DNA上進行成環擴增，LAMP需要4～6條引物，引物區別在于有無Loop F/B。這些引物要與目標DNA/RNA的特定部位互補配對，擴增啟動從內部引物入侵開始，鏈置換型DNA酶會將該引物延伸，使雙鏈DNA解開，外部引物會將合成的鏈替換下來，并開始新DNA的延伸，當合成的鏈被替換下來，其鏈端會形成自雜交的環狀結構。這是因為被替換下來的引物端中包含一個反向互補序列，引物延伸和鏈置換會交替發生在靶序列的兩端，最終的產物是短啞鈴結構的DNA，它可以作為擴增的起始結構，該環狀結構包含多個起始位點，擴增會在多位點啟動，新DNA迅速合成并形成多聯體，且都有多個起始位點，最終雙鏈DNA和擴增副產物迅速累計，產物檢測有多種方法。

Gunimaladevi等[29]建立了檢測虹鱒傳染性造血壞死病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV）的反轉錄環介導等溫擴增和環介導等溫擴增檢測方法，在同等條件下兩種方法的結果近似，靈敏度比傳統巢式PCR技術高10倍。Min Z等[30]建立了能夠檢測3種蛙病毒的環介導等溫擴增檢測技術，且不會與非目的病毒發生反應，最低檢測限度為100拷貝數/μL。LAMP的優勢在于檢測的靈敏度很高，可以檢測到fg級別的核酸量，且成本較低，但是LAMP的特異性還有待提高。

3 總結

在科技飛速發展的當代，檢測技術層出不窮，實現水產養殖病原檢測變得容易。以免疫學為例，相較傳統的微生物技術，免疫學檢測技術靈敏度高﹑特異性強﹑速度快。免疫學技術在水生動物領域的應用優勢體現在疫病防治，免疫學疫苗的使用通過增強生物體的體質，這樣可以減少經常用藥對水產品帶來的負面影響，還可以研發免疫品種，免疫學技術在水產養殖業的前景非常廣闊。分子生物學檢測技術是檢測技術中的佼佼者，無論是成本﹑速度﹑靈敏度﹑高通量性都是最優選擇，且分子生物學檢測技術類型多，各有特點，能夠符合多種檢測需求。分子生物學檢測技術在水生動物疫病檢測中的應用越來越多，對水產養殖的疫病防控具有重要意義。