葉綠體介導的植物抗病毒防衛反應及病毒的反防御機制研究進展

李宗迪, 王亞琴, 吳建祥, 周雪平,2*

(1. 浙江大學農業與生物技術學院，杭州 310058；2. 中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193)

葉綠體是植物光合細胞的重要細胞器,不僅能進行光合作用為植物的生長發育提供能量,也在植物的免疫系統中扮演著核心角色[1-2]。葉綠體是植物細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成、抗病激素水楊酸(salicylic acid, SA)和茉莉酸(jasmine acid, JA)生物合成以及鈣離子儲存的重要場所[3]。作為植物細胞內免疫信號的核心樞紐,葉綠體還能夠通過逆行信號(retrograde signal, RS)來平衡植物激素間的串擾和實現細胞器間的信號交流,從而改變各種蛋白質的表達,調控光合作用和葉綠體免疫反應[4-7]。近年來,葉綠體免疫與植物病毒之間的相互作用受到越來越多的關注。本文將從葉綠體免疫反應抵抗植物病毒侵染以及植物病毒干擾葉綠體免疫反應這兩個方面進行綜述,并展望葉綠體免疫與植物病毒互作領域的未來研究方向。

1 葉綠體免疫反應抵抗植物病毒侵染

1.1 葉綠體活性氧介導對植物病毒的抗性

在植物病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)觸發的免疫反應(PAMP-triggered immunity, PTI)過程中,位于細胞膜表面的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識別相應的PAMP后會磷酸化蛋白激酶BAK1(brassinosteroid-insensitive 1-associated receptor kinase 1),磷酸化的BAK1再經過一系列的磷酸化反應激活細胞膜上的RBOHD(respiratory burst oxidase homolog protein D, RBOHD),促使質外體ROS的快速生成[8]。在植物細胞內,線粒體、葉綠體及過氧化物酶體都能產生ROS,但是Wrzaczek等發現在具有光合能力的組織中,葉綠體是植物細胞內ROS生成的最主要場所[9]。葉綠體活性氧(chloroplast ROS, cROS)的生成依賴于在類囊體膜上進行的光合電子傳遞。在類囊體膜上進行的光反應除了將植物吸收的光能轉化為能量ATP和NADPH,并將水分解生成氧分子(O2)和質子(H+)之外,還會生成諸如超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)等活性氧物質[10]。其中,光系統Ⅱ、細胞色素b6/f復合物、光系統Ⅰ是生成cROS的主要場所[10-11]。據報道,植物病毒的侵染能夠誘導cROS的迸發[12-14],病毒誘導生成的cROS除了可以誘發過敏性壞死反應(hypersensitive reaction, HR)限制病毒的侵染之外,還可以作為重要的信號分子將免疫信號逆向傳遞至細胞核,激活更強烈的免疫反應[15-16]。

Rosa Lozano-Duran團隊發現在番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)、甜菜曲頂病毒(beet curly top virus, BCTV)及茼麻花葉病毒(abutilon mosaic virus, AbMV)侵染的細胞中,會發生葉綠體向細胞核周圍聚集的現象[17]。進一步研究發現,ROS是核周圍葉綠體聚集的誘導劑,暗示著cROS可以作為信號分子促進葉綠體和細胞核間的交流,從而抵抗病毒的入侵[17]。此外,Caplan等發現在煙草中,具有核苷酸結合位點且富含亮氨酸重復序列的免疫受體(nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors, NLRs)N能夠識別煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus, TMV)復制酶p50的解旋酶結構域,誘導HR反應和植物對TMV的抗性[18]。葉綠體蛋白NRIP1(Nreceptor-interacting protein 1)與N免疫受體和p50間均存在直接的相互作用,并且N識別p50所介導的抗性需要NRIP1的參與[18]。在同時表達N和p50或者TMV感染的煙草細胞中,會出現NRIP1從葉綠體轉運至細胞核的現象,并且還可以觀察到葉綠體基質向外凸起形成基質小管(stroma-filled tubule, stromule)結構[18]。進一步的研究發現p50誘導的葉綠體stromule可以直達細胞核,并且可以觀察到NRIP1通過stromule從葉綠體向細胞核轉運的現象[16]。值得注意的是,對細胞內H2O2水平進行實時觀察的結果顯示,在葉綠體中生成的cROS可以通過stromule轉運至細胞核,而細胞核中的ROS積累可以激活下游更為強烈的免疫反應[16]。這些研究結果表明,cROS是葉綠體生成的重要免疫信號分子,并且可以通過stromule從葉綠體向細胞核的轉運,激發植物對病毒的抗性。

1.2 葉綠體合成的相關激素介導對植物病毒的抗性

植物激素在植物生長發育,響應生物及非生物脅迫過程中都起著關鍵作用,同時也參與了植株對植物病毒的防衛反應[19-21]。其中,水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)作為重要的抗病激素,兩者的生物合成與葉綠體密切相關[22-23]。

在葉綠體中,SA的合成主要通過異分支酸合酶途徑進行,SA的前體分支酸(chorismic acid, CA)在異分支酸合酶1(isochorismate synthase 1, ICS1)的催化下生成異分支酸(isochorismate, ISC),ISC再在氨基轉移酶PBS3的催化下直接生成SA[24]。葉綠體合成的SA通過EDS5(enhanced disease susceptibility 5)轉運至細胞質中,破壞細胞質中以低聚體形式存在的NPR1(nonexpressor of pathogenesis-related genes 1)蛋白的二硫鍵,使其成為單體。NPR1單體則會進入細胞核中激活病程相關(pathogenesis related, PR)蛋白的表達[25]。SA不僅可以誘導局部過敏性壞死反應,且與系統獲得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)密切相關[26]。Campos等證實SA處理后的番茄表現出對番茄花葉病毒(tomato mosaic virus, ToMV)更強的抗性,在接種病毒后發病時間延遲且病毒積累量顯著降低[27]。2014年,萬建民團隊克隆了第一個水稻條紋病毒(rice stripe virus, RSV)的抗性基因STV11[28]。STV11編碼一個磺基轉移酶,能夠將SA催化為磺化SA,磺化SA可以顯著增強水稻對RSV的抗性[28]。研究表明SA還通過干擾病毒的細胞間移動、長距離運輸和復制等過程以實現對病毒的防御[19-20, 29]。例如,Tian等發現番茄叢矮病毒(tomato bushy stunt virus, TBSV)的復制依賴于與三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的相互作用,而SA可以通過競爭結合GAPDH來抑制TBSV的復制[30]。

JA是一種脂質衍生的激素,它的生物合成主要通過十八烷途徑進行,該過程大部分階段發生在葉綠體中,合成的最后階段需要在過氧化物酶體中進行,而修飾JA的酶則在細胞質內[31]。JA合成途徑的底物是α-亞麻酸(α-linolenic acid,α-LeA),α-LeA在脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)的催化下生成13-氫過氧亞麻酸(13-hydroperoxy derivative 13(S)-hydroperoxy-octadecatrienoic acid, 13-HPOT),13-HPOT在丙二烯氧化物合酶(allene oxide synthase, AOS)和丙二烯氧化物環化酶(allene oxide cyclase, AOC)兩步催化下生成12-氧-植物二烯酸(12-oxo-phytodienoic acid, OPDA)。OPDA在過氧化物酶體中經過進一步還原和三步β氧化反應即可形成JA[32]。

研究發現外源施加JA可以誘導植物對包括番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)、TMV以及RSV在內的多種植物病毒的抗性[33-35]。此外,RSV編碼的外殼蛋白(coat protein, CP)能夠誘導細胞內JA的顯著積累,從而上調表達JA通路上的關鍵轉錄因子MYB(MYB transcription factor gene),并誘導RNA沉默通路上核心蛋白Argonaute 18(AGO18)的表達[36-37]。AGO18一方面能夠促進AGO1與病毒的干擾RNA(siRNA)結合,另一方面還能與AGO1競爭結合miR528,調控細胞內的氧化還原穩態,促進ROS的積累來增強水稻對RSV的抗性[36-37]。

1.3 鈣離子信號通路促進葉綠體免疫

葉綠體是植物細胞內鈣離子儲存的重要場所。鈣離子除了參與植物的生長發育過程之外,在植物響應多種生物和非生物脅迫過程中也發揮著重要的作用。病原物的侵染往往會導致植物體內的鈣離子水平發生變化,這種變化導致的鈣離子流動反應可以作為防御信號激活寄主體內的免疫反應。用銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa鞭毛蛋白N末端的22 aa短肽(flg22)、幾丁質(chitin)、隱地蛋白(cryptogein)和寡半乳糖醛酸(oligogalacturonic acid)誘發植物產生PTI反應后,可以在葉綠體基質中檢測到輕微但持久的鈣離子濃度升高[38]。Nomura等發現PTI引起的鈣離子信號的迸發會被定位于葉綠體的鈣敏感受體(calcium sensing receptor, CAS)感知。CAS是一種低親和力、豐度較高的鈣離子結合蛋白,位于類囊體膜上,是葉綠體免疫反應的關鍵蛋白,其在結合鈣離子后被磷酸化并調控葉綠體基質中的鈣離子濃度迅速增加。葉綠體中的鈣離子信號能夠激活SA的合成及細胞核內抗病相關基因的表達,從而抵抗各種病原物的侵染[38]。Medina-Puche等發現植物中鈣依賴蛋白激酶16(calcium-dependent protein kinase 16, CPK16)的N端同時具有豆蔻?；稽c和葉綠體轉運信號肽(chloroplast transit-peptide, cTP),其在PTI反應被激活的情況下,會發生從質膜向葉綠體的重新定位。CPK16在葉綠體中的積累能夠增強鈣離子信號傳遞、PR蛋白表達等一系列PTI反應。進一步研究發現在擬南芥中過表達葉綠體定位的CPK16能夠顯著促進擬南芥對TYLCV的抗性[39]。這項研究表明葉綠體介導的鈣離子信號可以直接參與植物的抗病毒反應。

1.4 光合作用相關蛋白參與對病毒的抗性

研究表明光合作用中的許多組分在抵抗病毒侵染方面有著關鍵的作用。例如,對核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基(rubulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit, RbcS)下調表達的煙草接種番茄花葉病毒(ToMV)和TMV后,感病癥狀加重,病毒積累量增加,并且病程相關基因PR1的表達受到了顯著的抑制[40]。此外,在RbcS被沉默的植株中抗性基因Tm-22介導的煙草和番茄對ToMV及TMV的抗性出現了顯著的減弱,表明RbcS在Tm-22介導的抗病毒過程中起到關鍵作用[40]。研究表明放氧復合體外周蛋白的兩個亞基PsbO和PsbP均參與了寄主抵抗病毒侵染的過程[41-42]。Abbink等發現利用TRV-VIGS沉默PsbO可以顯著促進TMV、苜蓿花葉病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)及馬鈴薯X病毒(potato virus X, PVX)對煙草的侵染[41],而Balasubramaniam等證實過表達PsbP能夠顯著抑制AMV的復制[42]。馬鈴薯Y病毒屬病毒復制的過程中需要形成包涵體(cylindrical inclusion, CI)。光系統Ⅰ中的PSⅠ-K蛋白能夠與李痘病毒(plum pox virus, PPV)形成的CI互作。PSⅠ-K由psaK基因編碼,本氏煙中的psaK下調表達能夠促進PPV的復制,表明PSⅠ-K具有顯著的抗病毒功能[43]。

2 植物病毒抑制葉綠體介導的免疫反應

2.1 病毒下調葉綠體免疫相關因子的表達

植物病毒的侵染通常會伴隨著褪綠、花葉等癥狀,暗示著病毒的侵染會導致光合作用相關蛋白(chloroplast photosynthesis-related proteins, CPRPs)出現不同程度的下調表達,而研究表明,大量CPRPs與葉綠體免疫密切相關。例如TMV的侵染導致光系統Ⅱ核心復合體中PsbA、LhcB1、LhcB2及放氧復合體PsbO顯著下調表達,抑制光系統的活性,從而促進病毒癥狀的形成[44]。此外,CMV和ToMV侵染也會下調煙草葉綠體中免疫相關因子的表達,如光系統Ⅱ中的PsbO、PsbP、PsbQ及光系統Ⅰ中psaK、psaH等基因的表達[45-46]。RSV侵染亦會導致水稻和本氏煙中CPRPs的表達水平顯著降低,從而抑制寄主的光合效率[47]。葉綠體中光合電子傳遞鏈的鐵氧還原蛋白Ⅰ(ferredoxin 1, Fd1)被證實能夠通過調控胞間連絲胼胝質的積累抵御PVX的侵染,而本氏煙被PVX侵染后NbFd1的表達被顯著抑制[48]。最新的研究表明,Fd1同樣可以負調控RSV的侵染,但由RSV RNA1二級結構產生的vsiR45349小干擾RNA能夠靶向并降解Fd1的mRNA,促使Fd1下調表達,從而促進病毒侵染。另一方面RSV侵染誘導植株中脫落酸(abscisic acid, ABA)大量積累,促進脫落酸通路上的轉錄因子ABI5(ABA insensitive 5)表達,ABI5能夠與Fd1基因啟動子上的ABA響應元件ABRE結合以負調控其表達,進一步促進病毒的侵染[49]。

2.2 病毒干擾葉綠體免疫相關蛋白的轉運

研究發現一些植物病毒編碼的蛋白能夠和葉綠體免疫相關蛋白互作并阻礙其進入葉綠體從而抑制葉綠體介導的免疫反應。例如,AMV的CP蛋白能夠與放氧復合體亞基PsbP互作,并阻礙其進入葉綠體,而不能形成二聚體的AMV CP突變體喪失了與PsbP互作的能力。鑒于過表達PsbP顯著增強了寄主對AMV的抗性,表明AMV CP很有可能通過劫持PsbP的方式抑制其介導的抗病毒反應[42]。類似地,過表達PsbP也能夠增強水稻和本氏煙對RSV的抗性,而RSV編碼的病害特異蛋白(disease specific protein, SP)可以通過和PsbP互作的方式限制其向葉綠體轉運,從而導致寄主葉綠體的結構發生紊亂及光合作用受到抑制,促進RSV的侵染[50]。此外,大豆花葉病毒(soybean mosaic virus, SMV)編碼的P1蛋白和甘蔗花葉病毒(sugarcane mosaic virus, SCMV)編碼的HC-Pro蛋白能夠分別和細胞色素b6/f復合體還原型鐵硫蛋白(cytochrome b6/f complex Rieske Fe/S)及鐵氧還蛋白5(ferredoxin 5, Fd5)互作。Rieske Fe/S蛋白和Fd5蛋白都是核編碼的葉綠體蛋白,且均與光合電子傳遞相關,而SMV P1與Rieske Fe/S間以及SCMV與Fd5間的互作均會抑制后者向葉綠體中轉運,從而抑制光合電子傳遞介導的免疫反應,促進病毒癥狀的發生[51-52]。

2.3 病毒抑制葉綠體向核聚集

葉綠體向細胞核周圍聚集的現象是植物響應生物脅迫的重要免疫應答[17]。研究發現葉綠體NADH脫氫酶復合體M亞基(NADH dehydrogenase-like complex M subunit, NdhM)可以誘導葉綠體在核周圍的聚集并顯著促進PR蛋白的表達以增強對蕪菁花葉病毒(turnip mosaic virus, TuMV)的抗性,而TuMV編碼的VPg蛋白能夠和NdhM在細胞核和核仁中發生相互作用,阻礙NdhM進入葉綠體,抑制NdhM所介導的核周葉綠體聚集[53]。進一步研究發現本氏煙的NdhM除了能夠和TuMV編碼的VPg蛋白互作之外,還可以和PPV編碼的VPg蛋白及RSV編碼的P2蛋白發生互作。此外,TuMV編碼的VPg蛋白還可以和擬南芥及番茄的NdhM互作。這表明NdhM可能是病毒抑制葉綠體免疫的一個普遍靶標[53]。類似地,辣椒葉綠體外膜蛋白OMP24也被發現能夠誘導葉綠體向細胞核聚集、stromule的形成及cROS的積累,從而促進葉綠體向細胞核逆行信號的傳遞。過表達OMP24能夠增強辣椒對辣椒輕斑駁病毒(pepper mild mottle virus, PMMoV)的抗性,并且OMP24介導的抗病毒能力依賴于其在葉綠體外膜的定位和其自身的相互作用[54]。然而,PMMoV編碼的CP蛋白能夠通過與OMP24直接互作的方式干擾OMP24自身互作,從而抑制其介導的免疫反應[54]。

2.4 病毒干擾免疫相關分子的合成

Reinero等在1986年報道了TMV的外殼蛋白能夠進入煙草的葉綠體,這是關于病毒蛋白靶向葉綠體的首次報道[55-56]。近年來,一些研究發現植物病毒蛋白可以通過直接進入葉綠體的方式干擾免疫相關分子的合成以增強自身的毒性。例如,RSV編碼的NSvc4蛋白能夠在其N端1-20位氨基酸的引導下直接進入本氏煙的葉綠體,定位葉綠體的NSvc4蛋白的表達能夠顯著抑制cROS的合成和PR基因的表達[57]。進一步研究表明,NSvc4和葉綠體中的NbGAPDH-A及NbPsbQ互作,利用TRV-VIGS下調表達NbGAPDH-A和NbPsbQ能顯著促進RSV對本氏煙的侵染,暗示著這兩個基因很有可能參與了寄主對RSV的抗性[57]。

Rosa Lozano-Duran團隊報道了CPK16蛋白從質膜向葉綠體的轉運能夠增強寄主對包括病毒在內的多種病原物的抗性,TYLCV編碼的C4蛋白與CPK16類似,其N端同樣具有豆蔻?；稽c和cTP,在病毒侵染時會發生從質膜向葉綠體轉運的現象,定位于葉綠體的TYLCV的C4蛋白通過和CAS互作干擾鈣離子信號的傳遞進而抑制SA的合成[39]。有意思的是,一些其他雙生病毒編碼的蛋白和細菌的效應子也具有質膜和葉綠體的雙重定位信號。例如,BCTV編碼的C4蛋白和青枯雷爾氏菌Ralstoniasolanacearum分泌的GALA1效應蛋白在寄主免疫反應被激活的情況下,均會從質膜轉運至葉綠體中,并能夠抑制胼胝質的積累、PR基因和SA通路上關鍵基因的表達[39]。這項研究不僅揭示了植物中存在一條連接質膜和葉綠體的重要免疫信號途徑,還暗示了不同類別的病原物進化出了相似的策略來對抗該途徑以削弱植物免疫反應,從而促進自身侵染。

此外,Ji等發現由核基因編碼的JA合成通路上的關鍵蛋白AOC在細胞質中被翻譯之后,需要在葉綠體信號識別顆粒54(chloroplast signal recognition particle 54, cpSRP54)的幫助下轉運至類囊體中相應的位點發揮其功能。而TuMV編碼的P1蛋白可以和cpSRP54發生互作并將其降解,從而干擾JA的合成,促進病毒的侵染[58]。PVX編碼的p25蛋白以及辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)編碼的126 kD蛋白也可以和cpSRP54互作并將其降解,暗示cpSRP54很有可能是多種病毒用以抑制JA信號通路的普遍靶標[58]。

3 展望

近年來,大量新的研究證實葉綠體在植物與病毒的軍備競賽中扮演著至關重要的角色。葉綠體一方面作為細胞內免疫信號網絡的核心樞紐增強植物的抗病毒能力,另一方面也成為病毒攻擊的關鍵靶點。葉綠體免疫是一個新興研究領域,今后關于植物病毒與葉綠體免疫相互作用的研究應聚焦于進一步挖掘具有抗病毒功能的寄主葉綠體因子、解析葉綠體逆行信號在植物抗病毒反應中的關鍵作用以及病毒如何與葉綠體互作來抑制寄主的抗性。此外,還有一些基礎的問題亟待解決,例如:植物病毒侵染誘導的cROS是如何產生的?cROS在免疫反應過程中的時空動態變化如何?葉綠體在細胞核周圍聚集的意義?葉綠體與其他細胞器間存在怎樣的逆行信號?是否存在抑制病毒蛋白靶向葉綠體的寄主因子,從而減弱病毒的致病性?但目前的研究手段尚不能解決上述的問題,例如對免疫信號的時空動態觀察,這就需要發展新的方法和工具。此外,目前常規的病毒蛋白與葉綠體互作研究的技術路線多是采用酵母雙雜交文庫篩選和質譜分析等方法,通過這類方法篩選得到的寄主因子還需進行葉綠體定位分析方能確定其是否為葉綠體相關的寄主因子。今后的研究可以考慮構建葉綠體相關基因的cDNA文庫或是提取葉綠體蛋白直接進行質譜分析,從而提高篩選的效率和準確性。此外,新的蛋白質互作研究方法也值得應用,例如基于TurboID的鄰近標記技術,該技術能夠檢測細胞內瞬時發生或微弱的蛋白質互作[59]。相信隨著新的研究工具的研發,上述問題都能找到答案,這不僅有助于對葉綠體生物學的基本理解,而且將對開發具有廣譜抗性的新作物具有重要意義。