銀柴胡組培快繁研究進展※

●李天順 代曉華 （寧夏大學農學院 寧夏 銀川 750000）

銀柴胡為石竹科植物銀柴胡（Stellaria dichotomaL? var? lanceolata Bge?）的干燥根，屬寧夏道地藥材，富含甾醇類﹑環肽類﹑黃酮類﹑生物堿類﹑酚酸類﹑揮發類等物質。銀柴胡有清虛熱﹑除疳熱的功效。研究發現，銀柴胡不僅具有清熱涼血功能，還具有抗炎﹑治療過敏性疾病﹑擴張血管等作用[1-3]。現國內多地進行了銀柴胡的人工栽培，如寧夏﹑內蒙古﹑陜西等，其中寧夏為銀柴胡種植大區。

現階段人工栽培銀柴胡產業主要存在種源混雜[4-6]﹑種子質量參差不齊﹑種子繁殖受環境影響大﹑產量低﹑品質差[7]等問題。為減少銀柴胡種子繁殖及種質資源混雜對產量﹑質量的影響，以改變繁殖方式來縮短栽培年限，加快育苗速度，規范種植標準，近年來已開始對銀柴胡的組織培養進行研究。植物組織培養可以使用從母體上采集的根﹑莖﹑葉等器官作為材料進行大規模快速繁殖，從而有效解決種子繁殖發芽率低﹑受外界環境影響大等問題。植物組織培養屬于無性繁殖，新生植株可保留母體的優良性狀，從種源層面解決種質退化﹑種子質量參差不齊﹑不同品種性狀不一等問題。銀柴胡組織培養研究相較于其他組培研究起步較早的植物還處于初期階段。

1 銀柴胡的快繁途徑

藥用植物的快繁途徑一般分為三類：第一類，器官直接發生，即直接由離體的莖﹑葉﹑腋芽等組織器官上產生再生植株；第二類，器官間接發生，即先由離體的組織器官先誘導產生愈傷組織，再由愈傷組織間接誘導產生芽﹑根，最終產生再生植株；第三類，體細胞胚胎發生，即由外植體或愈傷組織產生的與正常受精卵發育類似的胚胎結構，經過合適環境培養生成再生植株[8]。

姚寧等[9]通過器官直接發生型途徑成功建立了銀柴胡植株再生體系，該研究以銀柴胡莖節為材料，通過添加植物生長調節劑直接誘導其分化出不定芽與不定根，最終獲得再生植株。而吳曉玲等[10]和胡海英等[11]基于器官間接發生型途徑對銀柴胡組培快繁進行研究，結果暫時停滯于外植體誘導愈傷組織﹑愈傷組織誘導毛狀根這一階段，未見后續報道。此外，體細胞發生型途徑的研究仍處于懸浮細胞培養階段[12-13]，尚未有通過此途徑成功建立再生植株體系的研究結果。現有研究中，只有器官直接發生型途徑能通過外植體產生再生植株，其他途徑仍處于探索階段，但該研究還處于初代培養階段，未進行繼代快繁與大田推廣實踐，所以當下銀柴胡主流繁殖方式仍為種子繁殖。

2 影響銀柴胡組織培養的因素

2.1 外植體的選擇

植物細胞在合適的條件下表現出細胞的全能性，即單個植物細胞具有能發育成為完整植株的潛力。外植體的選擇對于藥用植物的組培再生體系的建立十分關鍵，不同的取材部位﹑生理狀態﹑材料大小等因素，均會對培養結果產生直接影響。在近年銀柴胡同科或同類藥材的組培快繁研究中，韋瑩等[14]在短瓣石竹莖段誘導及植株再生研究中選擇當年生1?0～1?5 cm的帶芽幼嫩莖段作為外植體；趙晶[15]在甘草組織快繁技術及次生代謝產物的研究中發現，無菌苗的下胚軸是誘導甘草愈傷組織的最佳外植體；而葉片作為最容易獲得的外植體，其取材不受生長時間與季節的限制且采摘葉片對于母株的傷害較小，經常被用于人參﹑花毛茛等植物的組織培養中[16-17]。

研究表明[18]，石竹科植物的組培外植體一般為莖尖﹑莖段﹑葉片﹑花瓣。莖尖可以通過器官直接發生﹑器官間接發生兩種途徑建立再生體系；莖段可通過器官間接發生﹑體細胞胚胎發生兩種途徑建立再生體系；葉片可通過器官直接發生﹑器官間接發生﹑體細胞胚胎發生三種途徑建立再生體系，花瓣僅可通過直接誘導不定芽獲得再生植株。從誘導能力﹑發生途徑﹑獲取難度等因素綜合考量，莖段﹑葉片是銀柴胡組培快繁的理想外植體，這也符合銀柴胡組培相關研究的結論，即可由莖節直接誘導生成不定芽與不定根，最終形成再生植株[9]，也可由幼葉誘導形成愈傷組織生成不定根與銀柴胡細胞[10-13]。

2.2 外植體消毒

微生物引起的污染問題是制約當前植物組培成功的重要因素，精準高效的消毒措施能確保外植體在組培過程中不被污染，提高成功率[19]。

銀柴胡等藥用植物的消毒方法一般為多種藥劑交替浸泡法，該方法可有效殺滅外植體表面的微生物，降低污染率。步驟為：將外植體用洗潔精洗凈后置于流動清水中沖洗1～2 h，再使用NaClO﹑75%酒精﹑HgCl2等溶液在無菌環境下對其進行浸泡消毒。

姚寧等[9]研究表明，先將銀柴胡種子流水沖洗2 h，然后用75%酒精處理1 min，再用15%NaClO溶液處理10 min效果最好，污染率僅為 3?37%，萌發率為 97?15%。吳曉玲[10]則使用肥皂水清洗銀柴胡幼葉后，用蒸餾水沖洗干凈，然后用75%酒精浸泡10～15 s，無菌水沖洗4～5遍，最后用0?1%HgCl2溶液浸泡7～8 min，無菌水沖洗4～5遍完成消毒。

由于外植體的種類﹑抗性不同，因此，在使用NaClO﹑75%酒精﹑HgCl2等溶液進行消毒的過程中，應有針對性地控制溶液濃度及消毒時間。時間過長﹑濃度過高均會導致外植體受損或積累過多的重金屬，降低組培成功率；時間過短﹑濃度過低則會導致外植體消毒不徹底，提高感染率。

2.3 培養基的作用

培養基可為外植體生長發育提供所需的各種營養物質，由于不同的植物種類﹑外植體類型﹑誘導目標所需的營養成分有所差異，所以選用合適的培養基是植物組培成功的關鍵因素[20]。

培養基中氮源可以直接影響外植體的生長發育，Paek等[21]在MS培養基中銨態氮與硝態氮比例對人參不定根的影響研究中發現，低銨態氮與高硝態氮比例對人參不定根的生長有促進作用。岳建華等[22]對蔗糖濃度對百子蓮體胚成熟效果的研究中發現：碳源（蔗糖）是顯著影響百子蓮體胚成熟誘導效果的因素之一。此外，其他元素的添加，也對組培結果有影響。田鵬瑋[23]在人參懸浮細胞為材料對其培養條件進行優化的研究中發現，適當提高培養基中磷酸根與鈣離子的濃度可以提高其有效成分的積累。添加瓊脂也會對組培結果有一定的影響，因為瓊脂的雜質﹑吸水率﹑凝固硬度等特性可能會促進或抑制外植體的生長發育。

目前，銀柴胡的組培快繁一般使用無機鹽和離子濃度較高﹑離子平衡較為穩定的MS培養基﹑1/2MS培養基。姚寧等[9]在銀柴胡植株再生體系中，使用MS為基本培養基誘導莖節產生不定芽，誘導率為100%；以1/2MS為基本培養基誘導不定芽生根，生根率為90%；在對銀柴胡組培研究中，使用MS為基本培養基誘導葉片產生愈傷組織，并發現磷酸鹽（KH2PO4）含量為255 mg/L時，更有利于銀柴胡細胞的懸浮培養[10-11，13]，這一結論也與上文中結論相互印證。

2.4 植物生長調節劑的影響

不同的植物生長調節劑對植物發育方向起著重要的控制作用，在銀柴胡器官間接發生型途徑建立再生體系的過程中，誘導愈傷組織較為容易，但由愈傷組織分化為不定芽則暫無成功報道。而控制愈傷組織形成與分化的關鍵因素就是細胞分裂素與生長素的配比，吳曉玲等[10]在對銀柴胡愈傷組織誘導技術的研究中發現：MS+6-BA（1?0 mg/L）+NAA（1?0 mg/L）+2,4-D（1?0 mg/L）是誘導銀柴胡愈傷組織的最佳培養基配方。

而相較于間接誘導途徑，更為高效﹑簡便的器官直接發生途徑已建立起一套較為完整的再生體系。姚寧等[9]以莖節為外植體材料建立植株再生體系的研究表明，不定芽誘導的最佳培養基為MS+6-BA（1?5 mg/L），誘導率為100%，誘導不定芽生根的最佳培養基為1/2 MS+6-BA（0?3 mg/L）+IBA（0?5 mg/L），生根率為90%。

同樣，在體細胞胚胎發生型途徑建立銀柴胡再生體系的過程中，植物生長調節劑的作用十分顯著。吳曉玲等[12]在研究植物生長調節劑對銀柴胡細胞生長特性的影響中表明，培養基為MS+6-BA（1?0 mg/L）+NAA（1?0 mg/L）+2,4-D（1?0 mg/L）時，培育細胞的鮮重﹑干重﹑細胞數目均較高，該培養液還可有效增強銀柴胡細胞的硝酸還原酶的活性，提高氮素的利用率。而培養基為 MS+6-BA（1?0 mg/L）+NAA（0?5 mg/L）時，有利于增強銀柴胡細胞中過氧化氫酶的活性。

2.5 培養環境的影響

在植物組織培養過程中，光照﹑溫度﹑濕度等環境因素也是成功建立植株再生體系的關鍵。合適的培養環境可以加快植物生長發育，提高幼苗質量；而不當的培養環境則會導致植物生長緩慢﹑褐化﹑玻璃化甚至死亡。

劉榮等[24]在研究光照強度對葡萄愈傷組織形成的影響中發現，在外植體誘導愈傷組織階段，低光照或黑暗條件可有效提升愈傷組織的誘導率，降低褐化率，與高光照相比可提升愈傷組織的生長速率。同吳曉玲等[10]在暗條件下成功誘導銀柴胡愈傷組織，誘導率可達89?5%﹑褐化率僅為9?1%的結論。而通過外植體直接誘導銀柴胡再生苗的光照強度則為2200～2400 lx，光周期為14 h/10 h，不定芽的誘導率為100%﹑生根率為90%[9]。此外，Giovanni等[25]表明組培育苗時合適的光照可以提升銀柴胡種苗的質量。

合適的溫﹑濕度也是組培成功不可或缺的因素。研究表明，在一定的范圍內，溫度與香石竹玻璃化成正相關，溫度越低，玻璃化率越低[26]；環境濕度越高，組培苗玻璃化率越高[27]。銀柴胡組培快繁研究中多以溫度24～26℃，濕度70%～80%的環境條件進行，效果較為理想[9-11]。

3 存在問題及解決思路

3.1 組培途徑

現階段銀柴胡組培快繁技術仍處于初探階段，僅有姚寧等[9]采用器官直接發生途徑成功建立再生植株體系，獲得完整新個體，其他途徑尚未成功培育出新個體，器官間接發生途徑與體細胞胚胎發生途徑未成功建立再生植株體系中最關鍵問題就是愈傷組織分化困難。愈傷組織的分化與培養基的成分﹑培養環境﹑材料本身均有較大關聯[28]，其原因有可能是培養基成分配比失調，也有可能是培養環境不合適，或是銀柴胡本身不適合作為器官間接發生途徑的材料。下一步應系統性研究銀柴胡愈傷組織分化所需的條件，成功分化出胚狀體﹑不定芽﹑不定根，并進一步獲得完整新植株，以拓寬銀柴胡組培快繁的途徑，增加其應用場景。

3.2 藥材品質

在銀柴胡組培快繁技術的現有研究中，更傾向于對其再生體系的建立與快繁增殖，而忽略了其組培苗田間栽培品的藥材品質的對比研究。下階段應探究銀柴胡組培苗田間栽培品與其自然栽培品﹑野生品藥材品質在種苗質量與有效成分的差異性，如根長﹑根徑﹑干重﹑黃酮含量﹑皂苷含量等，再根據上述關鍵品質性狀的差異性反推指導組培快繁技術，提前淘汰品質低下﹑無實際價值的組培苗，篩選優良組培苗。進一步探索銀柴胡組培苗在移栽后對環境的適應性與變異情況，以便于更好地改良組培模式，提高藥材品質，適應生產需要。

3.3 遺傳穩定性

組培苗雖然繁殖系數高，但在長期的繼代培養過程中，其遺傳物質存在變異的可能性，而大量的遺傳變異會影響種苗的質量[29]。因此對銀柴胡組培苗遺傳穩定性檢驗的意義十分重大。在現代生物技術中，常使用簡單序列間重復（Intersimple sequence repeat， ISSR）進 行 DNA 分 子 標記，研究植物遺傳的多樣性；而在組培快繁中常使用甲基化敏感擴增多態性（Methylation sensitive amplification polymorphism， MSAP）來監測DNA甲基化水平與基因表達的關系，甲基化狀態通常與基因的表達失活有關[30]。下一步對銀柴胡組培苗遺傳穩定性的研究可依托ISSR﹑MSAP等技術手段進行，更深層次地優化改良組培過程中的選材﹑發生途徑﹑繼代次數等環節，減少銀柴胡組培苗在組培快繁過程中產生的遺傳變異，穩定其優良的遺傳性狀。