木棉皮抗消化道腫瘤活性部位篩選及抑制腫瘤轉移機制

薛中峰, 曾星開, 陶鑫, 覃驪蘭, 郭亞蕾

(1. 海南熱帶海洋學院食品科學與工程學院, 三亞 572022; 2.廣西中醫藥大學藥學院, 南寧 530200; 3.新疆科技學院醫學院, 庫爾勒 710025)

木棉皮(Bombaxceiba. L)來源于木棉科植物木棉BombaxmalabaricumDC.的樹皮。木棉別名紅棉、英雄樹(廣東)、攀枝花(云南)、斑芝棉、斑芝樹(臺灣)、攀枝(福建),是熱帶和亞熱帶地區廣泛栽培的優良樹種[1]。木棉皮性涼、味辛,歸胃、大腸經,具有清熱利濕、化瘀止血等功效,臨床常用于治療慢性胃炎、胃潰瘍、腿膝疼痛、瘡腫、跌打損傷等。木棉皮在民間作為治療食管癌、胃癌、腸癌等消化道腫瘤的常用藥物[2]。齊一萍等[3]發現木棉根醇提物可以明顯抑制小鼠宮頸癌細胞U4,王靜怡等[4]在木棉皮中分離得到羽扇豆醇、齊墩果酸等化學成分,其中羽扇豆醇可以通過caspase通路誘導腫瘤細胞凋亡和阻滯細胞周期從而抑制人肝癌細胞HCCLM3增殖[5]。 Lin等[6]提出齊墩果酸可以抑制肝癌細胞株Hep3B、Huh7的遷移和侵襲。

從中藥中發掘有效成分研究其抗腫瘤作用成為近年來的研究熱點。如通過數據挖掘、網絡藥理學和分子對接等方法證實中藥治療肺癌主要通過多成分、多靶點調控腫瘤壞死因子信號通路、鉑耐藥通路、il-17 信號通路等達到治療肺癌的效果[7]。核心中藥組合主要通過誘導凋亡、阻滯周期、抗血管生成和調控炎癥等途徑治療原發性肝癌[8]。

課題組前期研究發現,木棉皮提取物可誘導胃癌細胞凋亡,阻止胃癌細胞轉移[9]。本實驗探究木棉皮醇提物不同極性萃取部位對人消化道惡性腫瘤細胞抑制作用及活性部位對敏感細胞的遷移、侵襲作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

95%乙醇(分析純,天津大茂化工廠);乙酸乙酯(分析純,天津大茂化工廠);石油醚(分析純,天津大茂化工廠);正丁醇(分析純,天津大茂化工廠);二甲基亞砜(分析純,天津大茂化工廠);杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM)(biological industries,批號:90013);低限基本培養基(minimum essential medium, MEM)(biological industries,批號:41500034);洛斯維·帕克紀念研究所-1640培養基(Roswell Park Memorial Institute-1640, RPMI-1640)(Biological industries,批號:C22400500BT);胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(biological industries,批號:1921005PJ);磷酸緩沖液(phosphate belanced solution, PBS)(biological industries,批號:0780-2PK); CCK-8(cell counting kit-8)(新賽美,批號:AR1160);胰蛋白酶(biological industries,批號:T0303);青鏈霉素(biological industries,批號:15140-122);二甲基亞砜(細胞級)(solarbio,批號:S24295);5-FU氟尿嘧啶(solarbio,批號:GS2395);Trizol Reagent(thermo fisher scientific,批號:5596-06);DNase I (RNase-Free)(美國New England Biolabs, Inc.,批號:M0303S);First strand cDNA synthesis kit(thermo fisher scientific,批號:K6);QuantiNova SYBR Green PCR Kit (500)(德國QIAGEN公司,批號:08054);DEPC(DIETHYL PYROCARBONATE)(美國Sigma公司,批號:V90088-0ML);PI/RAase staining buffer(BD biosciences,批號:55085)。木棉皮采購于廣西玉林藥材市場,經廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定為木棉科木棉屬植物的干燥樹皮。人肝癌HepG2細胞、人胃癌SGC7901細胞、人結腸癌SW480細胞、人胰腺癌PANC-1細胞,購自中科院上海細胞庫。

75004240型離心機(賽默飛世爾科技有限公司);Multiskan Sky型全波長酶標儀(美國Thermo公司);CKX41型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司);DMI8型熒光倒置顯微鏡(德國LEICA公司);BSA224S型精密電子天平(賽多利斯科學儀器 (北京)有限公司);SB100D型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);HWS-12型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司);HVA-110型高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司);AF206as型雪花制冰機(斯科茨曼制冰系統有限公司);DW-86L626型超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司);Biometra TOne型PCR儀(德國耶拿分析儀器股份公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備

取木棉樹皮,室溫通風晾干后,粉碎成粗粉。取粗粉500 g,精密稱定,置于10 L的圓底燒瓶中,加入10倍量95%乙醇溶劑,密塞封閉,靜置1 h后,連接回流冷凝管,加熱至沸騰,并保持微沸1 h。放冷后,取下圓底燒瓶,密塞搖勻,用干燥濾器濾過。置于旋轉蒸發儀減壓回收乙醇溶劑,濃縮至稠膏,低溫干燥,得干膏。將干膏用100 mL蒸餾水溶解,轉移至分液漏斗中,依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,直到萃取液顏色變淺至無色即可更換下一組溶劑,回收萃取液后分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位共4個組分,各稱重,4 ℃保存備用。

1.2.2 細胞培養

處于正常生長狀態的腫瘤細胞,加入含有10% FBS的完全培養基,在37 ℃,5% CO2培養箱中培養,取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.3 CCK-8法篩選木棉皮醇提物抗腫瘤活性部位

取對數生長期的腫瘤細胞,棄原培養液,用無菌的PBS沖洗3次,加入適量胰酶進行消化,離心收集細胞。棄上清,加入適量新鮮的培養液,反復吹打使之成為單細胞混懸液。進行細胞計數,調整細胞濃度為5×104個/mL,按每孔100 μL接種于96孔板中。在細胞培養箱中培養24 h,并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。將細胞分為對照組、木棉皮石油醚部位不同濃度組、木棉皮乙酸乙酯部位不同濃度組、木棉皮正丁醇部位不同濃度組和木棉皮水部位不同濃度組。將準備使用的藥物(根據預實驗結果,以生藥量計,藥物濃度分別為 0.5、5、50、500 μg/mL)用二甲基亞砜溶解成均一溶液,用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾除菌,用不含血清的細胞培養液稀釋成所需的藥物濃度,每孔100 μL,設置5個平行孔。對照組加入100 μL新鮮培養基(含有和樣品等量的二甲基亞砜)。培養24 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,孵育2 h。用酶標儀在450 nm波長下測定各孔的光密度(optical density, OD)值。取五個平行孔平均OD值,計算細胞抑制率,當細胞抑制率為50%時,所對應的藥物濃度為半數抑制濃度即IC50。

1.2.4 細胞劃痕實驗

用marker筆在6孔板背部做直線,使兩條直線間隔0.5～1 cm。取敏感細胞,加入0.25%胰蛋白酶0.5 mL使其覆蓋細胞表面后,消化至細胞變圓脫落,加入完全培養液5 mL終止胰酶消化,吹打成細胞懸液并轉移至15 mL離心管中,800 r/min離心3 min棄去上清,加入完全培養基1 mL重懸細胞并計數,將細胞密度調整至8×105個/mL,按1 mL/孔接種6孔板,置于條件為37 ℃,5% CO2培養箱中培養。將細胞分為對照組、木棉皮低劑量組(50 μg/mL)、木棉皮中劑量組(100 μg/mL)、木棉皮高劑量組(150 μg/mL)、5-FU組,每組設5個復孔。接種后第二天細胞密度達80%以上,加入含有相應濃度木棉皮石油醚部位培養基處理細胞,按照預定實驗分組加入對應藥物孵育24 h后劃痕。細胞培養過夜,匯合度達100%,用一次性移液器槍頭垂直于6孔板背部的橫線劃痕,PBS清洗細胞2次,去除脫落的細胞,加入無血清培養基,置于37 ℃,5% CO2培養箱培養。分別于0、24、48、72 h進行拍照(≥3個視野/h),并將各組照片用Image J軟件計算遷移面積,得到不同時間點劃痕空白面積的大小。

1.2.5 Transwell侵襲實驗

取對數生長期的SGC7901細胞,按1.2.4節下方法分組與給藥。Transwell小室經無血清培養基進行基底膜水化,matrigel膠按1∶8稀釋后包被于Transwell小室上室,冰上平衡30 min后37 ℃孵育30 min使matrigel膠聚合成凝膠備用。取準備好的細胞,加入0.25%胰蛋白酶1 mL使其覆蓋細胞表面后,消化至細胞變圓脫落,加入完全培養基3 mL終止消化,吹打成細胞懸液并轉移至15 mL離心管中,800 r/min,離心3 min棄去上清,加入無血清培養基1 mL重懸細胞并計數,將細胞密度調整至2×105個/mL,分別取100 μL加入Transwell小室上室中并在下室加入500 μL的完全培養基,放入37 ℃,5% CO2培養箱中培養。細胞孵育7 h后將小室取出,4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗兩次后,用1%結晶紫染色30 min,PBS洗凈殘留的染液,用棉棒輕輕擦去上室的細胞,顯微鏡下選取5個視野拍照。用300 μL 33%醋酸洗脫小室底面的結晶紫,各孔取100 μL加入96孔板,用酶標儀讀取OD590值。

1.2.6 細胞黏附實驗

取對數生長期的SGC7901細胞,按1.2.4節下方法分組與給藥。96孔板每孔加入100 μL包被液,放置于2～8 ℃的冰箱下過夜,移除包被液,用洗滌液沖洗2、3次。以5×104個/每孔接種于96孔板,每組5個平行孔。放于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中孵育30 min。取出96孔板,去除培養基,用1640培養基反復洗滌3次,加入新鮮的培養基。每孔加入10 μL細胞染色液,孵育30 min。在酶標儀波長為450 nm處檢測樣品的OD值,計算細胞黏附抑制率。

1.2.7 qPCR法檢測MMP-2和MMP-9基因的mRNA轉錄水平

取對數生長期的SGC7901細胞,按“1.2.4”節下方法分組與給藥。將細胞置于37 ℃,5% CO2細胞培養箱中培養24 h。胰酶消化后,分別收集各組SGC7901細胞。按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA,去除DNA,取1 μg RNA進行逆轉錄,以GAPDH基因為內參,qPCR法對MMP-2和MMP-9基因表達水平進行檢測。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 The primer sequence

1.2.8 統計學方法

2 結果

2.1 木棉皮醇提物不同極性萃取部位對消化道腫瘤細胞增殖的影響

CCK-8法顯示,木棉皮醇提物石油醚部位對人胃癌細胞SGC7901和人肝癌細胞HepG2的抑制率最大,且對人胃癌細胞SGC7901最敏感,提示木棉皮醇提物石油醚部位為木棉皮抗消化道腫瘤的活性部位。而木棉皮醇提物乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位對各消化道腫瘤細胞抑制作用均不明顯。因此,本實驗以木棉皮醇提物石油醚部位為最佳有效部位用于下一步實驗,其抑制人胃癌細胞SGC7901和人肝癌細胞HepG2的IC50值分別為(71.8±1.8) μg/mL和(74.1±2.6) μg/mL。見表2。

表2 木棉皮不同萃取部位抑制各消化道腫瘤細胞的IC50值Table 2 The IC50 value of the petroleum ether part of alcohol extract of Bombax ceiba against gastrointestinal tumors

2.2 木棉皮醇提物石油醚部位對胃癌細胞遷移能力的影響

實驗結果顯示不同濃度下木棉皮醇提物石油醚部位不同時間點的遷移面積變化情況。與空白組相比,50、100、150 μg/mL木棉皮醇提物石油醚組均在48 h、72 h遷移面積減小,差異具有統計學意義(P<0.05)。結果顯示,隨著木棉皮醇提物石油醚部位濃度增加,在48 h及72 h時間段的遷移面積相對于空白組有所減小。見表3、圖1。

表3 不同濃度木棉皮醇提物石油醚部位對 胃癌細胞遷徙能力的影響Table 3 Effect of different concentrations of the petroleum ether part of alcohol extract of Bombax ceiba on the migration ability of gastric cancer cells n=5)

2.3 木棉皮醇提物石油醚部位對胃癌細胞侵襲的影響

實驗結果顯示,與空白組相比,50、100、150 μg/mL木棉皮醇提物石油醚組的OD值減小,差異具有統計學意義(P<0.05)。隨著木棉皮石油醚部位濃度增加,腫瘤細胞各對應組OD值變小,說明隨著給藥濃度的上升,腫瘤細胞侵襲細胞數目變少。木棉皮醇提物石油醚部位有抑制腫瘤細胞侵襲能力且在一定濃度范圍呈劑量依賴性。見表4、圖2。

圖2 木棉皮醇提物石油醚部位對胃癌細胞侵襲的影響(×200)Fig.2 Effects of different concentrations of the petroleum ether part of alcohol extract of Bombax ceiba on the invasion of gastric cancer cells (×200)

表4 不同濃度木棉皮醇提物石油醚部位作用下對 胃癌細胞侵襲的影響Table 4 Effect of different concentrations of the petroleum ether part of alcohol extract of Bombax ceiba on the invasion of gastric cancer cells n=5)

2.4 木棉皮醇提物石油醚部位對胃癌細胞黏附的影響

由實驗結果可知,與空白組相比,50、100、150 μg/mL木棉皮醇提物石油醚組的黏附抑制率顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)。隨著木棉皮醇提物石油醚部位濃度增加,細胞黏附抑制率逐漸上升。見表5。

表5 不同濃度木棉皮醇提物石油醚部位對 胃癌細胞黏附的影響Table 5 Effect of different concentrations of the petroleum ether part of alcohol extract of Bombax ceiba on the adhesion of gastric cancer cells n=5)

2.5 木棉皮醇提物石油醚部位對MMP-2和MMP-9基因mRNA轉錄水平的影響

實驗結果表明,與空白組相比,50、100、150 μg/mL木棉皮醇提物石油醚組明顯抑制MMP-2和MMP-9基因的mRNA轉錄水平,差異有統計學意義(P<0.05)。隨著木棉皮醇提物石油醚部位濃度增加,MMP-2和MMP-9基因的mRNA轉錄水平均減少,見表6。

表6 不同濃度木棉皮醇提物石油醚部位對MMP-2和 MMP-9基因mRNA轉錄水平的影響Table 6 Effect of different concentrations of the petroleum ether part of alcohol extract of Bombax ceiba on MMP-2 and MMP-9 gene mRNA transcription level n=5)

3 討論

目前,消化道惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一。胃癌病人的死亡率是常見惡性消化道腫瘤中死亡率最高的。根據數據統計,全世界每年新增胃癌患者高達90萬例,每年將近70萬例死于胃癌[10]。在早期胃癌很大一部分患者沒有任何感覺,因此往往被人們所忽視,容易錯過最佳的治療時機。胃癌臨床上多手術性治療、放療和中西醫結合治療[11],但由于晚期胃癌病人常常因為癌細胞擴散而不能得到有效地救治,因此保證胃癌的早期診斷和治療特別有必要。

測定細胞活力的方法很多,CCK-8法相對于3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)比色法,無需自己配制溶液、實驗過程中不用反復吸取溶液和加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO),避免了反復吸取溶液帶來的誤差,具有靈敏度高、穩定性好、操作簡便、低毒,是檢測細胞活力的常用方法,故采用CCK-8法測定木棉皮醇提物不同極性萃取部位對消化道惡性腫瘤細胞活性的抑制作用。實驗結果表明木棉皮醇提物石油醚部位為木棉的抗腫瘤活性部位,敏感細胞為人胃癌SGC7901細胞。

遷移和侵襲是惡性腫瘤最本質的生物學特征,惡性腫瘤細胞一般通過細胞通路、抑制細胞凋亡、促進血管生成等方式參與細胞遷移和侵襲過程[12]。由細胞劃痕,侵襲和黏附實驗結果可知,木棉皮醇提物石油醚部位隨著藥物濃度的升高可以減小細胞遷移的面積和侵襲細胞數目,提高細胞黏附抑制率。Transwell實驗進一步證明木棉皮醇提物石油醚部位可以顯著抑制人胃癌腫瘤細胞SGC7901的侵襲。Martrigel基質膠是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質成分,能在1640培養基中形成膜結構鋪于Transwell小室里,這種膜結構與天然基質膜十分相似,因此本實驗通過Martrigel基質膠的細胞數目來評價腫瘤細胞侵襲能力強弱。研究發現木棉皮醇提物石油醚部位組穿過Martrigel基質膠的腫瘤細胞數隨著藥物濃度增加而減少。細胞外基質(extracellular matrix, ECM)和基底膜是抵御腫瘤細胞遷移和侵襲的重要防線,腫瘤細胞能夠進行遷移和侵襲的首要條件是破壞其細胞外基質和基底膜[13]。黏附實驗顯示隨著木棉皮給藥濃度提高,細胞黏附抑制率增加,說明木棉皮醇提物石油醚部位可以通過抑制細胞黏附從而阻止腫瘤細胞的遷移和侵襲。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一個大家族,因其需要 Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名[14]。MMPs幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分,破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障,在腫瘤侵襲轉移中起關鍵性作用,被認為是該過程中主要的蛋白水解酶[15]。MMP-2和MMP-9是MMP家族中的重要成員,在腫瘤侵襲和轉移中發揮著重要作用[16]。木棉皮醇提物石油醚部位可明顯抑制MMP-2和MMP-9基因的mRNA轉錄水平。

4 結論

(1)木棉皮醇提物不同極性萃取部位中石油醚部位對人胃癌細胞SGC7901和人肝癌細胞HepG2的抑制率最大,且對人胃癌細胞SGC7901最為敏感,可知木棉皮醇提物石油醚部位為木棉皮抗腫瘤的活性部位。

(2)細胞遷移、侵襲和黏附實驗結果表明木棉皮醇提物石油醚部位可以抑制人胃癌SGC7901細胞的遷移、侵襲并抑制其黏附,木棉皮醇提物石油醚部位可通過調控MMP-2和MMP-9基因表達從而抑制人胃癌SGC7901細胞遷移和侵襲。提示該部位可能有抑制轉移性胃癌細胞引起的繼發性腫瘤作用,具有被開發為一種抗胃癌腫瘤新藥的潛力。