鴨腦微血管內皮細胞培養鑒定及其永生化細胞系的建立

黃國梁，吳曉妮，鄒榮華，李倩倩，葛家振，宋國棟，鄭福英*，藺國珍*

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所 動物疫病防控全國重點實驗室，甘肅 蘭州 730046）

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是鴨漿膜炎的病原[1]，也可感染鴨的腦組織導致腦膜炎，對中樞神經系統造成損傷，發病鴨表現出明顯的神經癥狀。目前關于該菌如何導致鴨腦膜炎的致病機制尚不清楚。

細菌導致宿主發生腦膜炎，首先要突破宿主的血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）。BBB主要由腦微血管內皮細胞（Brain microvascular endothelial cells，BMECs）、星形膠質細胞、周細胞和基膜構成，可以控制腦實質和血液循環之間的物質交換，阻止病原微生物和毒素入侵腦組織[2]。研究表明，BMECs是研究細菌突破BBB的經典模式細胞，以宿主的BMECs作為體外細胞模型，已經發現多個與細菌侵襲BBB相關的毒力因子。基于此，本研究分離培養鴨BMECs原代細胞并將其永生化，得到永生化鴨BMECs，為研究RA入侵鴨腦組織的相關毒力因子及其致病機制提供體外細胞系。

機體組織來源的細胞在體外環境條件下培養可分裂增殖，經過有限次傳代后，體外環境培養的細胞就會停止增殖，發生衰老和死亡，這種現象稱之為海弗利克極限（Hayflick limit）[3]。細胞經過自發的或受外界因素的影響突破限制，從而具有無限增殖能力的過程稱為細胞永生化。原代細胞因為Hayflick limit無法在體外長期保持內皮細胞的活性，因此建立永生化鴨BMECs能為研究RA的致病機理提供一個穩定的BBB模型。

本試驗采用胰酶消化法從鴨胚腦組織中分離BMECs，并通過慢病毒轉染和嘌呤霉素篩選的方法對BMECs進行轉染和篩選，同時采用細胞免疫熒光染色的方法分別對原代BMECs和永生化細胞系細胞進行免疫熒光染色觀察和鑒定，以期獲得高純度BMECs及其永生化細胞系。

1 材料

1.1 試驗動物

櫻桃谷受精鴨蛋10枚，購自江蘇圣安農業開發有限公司。

1.2 試驗試劑

胎牛血清（1414426）、0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，1734858）購自Gibico公司；內皮細胞完全培養基（PriMed-iCell-001）購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司；多聚甲醛（PFA，P1110）、DAPI（C0060）、Triton X-100（T8200）、山羊血清（S9070）均購自Solarbio公司；vWF（11778-1-AP）、Goat anti-Rabbit lgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 488（SA00006-2）均購自proteintech公司；Fluoromount-G熒光封片劑（0100-01）購自SourthernBiotech公司。

1.3 試驗儀器

T25細胞培養瓶（430639）購自Coming公司；血球計數板（Neubauer improved）購自Marienfeld公司；24孔板專用細胞爬片（YA0350）購自Solarbio公司；細胞培養孔板（WHB-24）購自上海臥宏生物科技有限公司；生物安全柜（濟南鑫貝西生物技術有限公司）；CO2細胞培養箱（上海博迅實業有限公司）；熒光倒置顯微鏡（Nikon，日本）；高速冷凍離心機（Thermo Fisher，美國）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；電熱恒溫震蕩水槽（上海精宏實驗設備有限公司）。

2 方法

2.1 櫻桃谷鴨BMECs分離培養

取孵育20 d櫻桃谷鴨胚1個，在生物安全柜中無菌分離鴨胚大腦皮質，去除腦膜后用PBS沖洗3次，再用無菌眼科剪將沖洗干凈的大腦皮質剪成1 cm3大小的組織塊，置于培養瓶中，加入2 mL內皮細胞完全培養基，確保組織塊不懸浮，倒置于5% CO2細胞培養箱中培養2 h，然后將培養瓶正置。待組織塊周圍生長的細胞融合成片即可去除組織塊，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化細胞，重新鋪瓶，培養至細胞鋪滿瓶底約80%，得到原代鴨BMECs。

2.2 細胞形態學觀察

用倒置顯微鏡對培養的原代櫻桃谷鴨BMECs進行觀察，并拍照記錄。

2.3 免疫熒光染色

取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培養基1 mL，加入原代鴨BMECs 2×104個/孔，培養48 h。細胞鋪滿玻璃片約80%后，吸出培養基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4 ℃環境下固定30 min。用PBS洗3次，每次5 min。將玻片吸干水分后用配制好的封閉液（0.5% Trition X-100與PBS按1∶1混合后再加入10%牛血清白蛋白）室溫封閉2 h。吸去封閉液后實驗孔滴加1∶200兔抗鴨血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）抗體，對照孔加入等量PBS代替一抗，置于4 ℃孵育過夜；PBS洗細胞爬片3次，每次5 min；室溫避光加入FITC標記的羊抗兔IgG（H+L），孵育2 h，用PBS清洗爬片3次，每次5 min。吸干水分后滴加1∶1 000稀釋后的DAPI染液避光染色5 min，用PBS清洗爬片3次，每次5 min。吸干液體后加入Fluoromount-G熒光封片劑進行封片，置于熒光倒置顯微鏡下觀察采集圖片信息。

2.4 鴨BMECs永生化細胞系的建立

2.4.1 慢病毒轉染鴨BMECs 將原代鴨BMECs接種6孔板（1×105個/孔），置于5% CO2培養箱培養，待細胞貼壁后，棄培養基加入新鮮內皮細胞完全培養基，并加入20 μL SV40過表達慢病毒質粒，混勻后繼續培養12 h，更換新鮮內皮細胞完全培養基繼續培養。當細胞長滿板底后傳代至T25培養瓶中繼續培養。

2.4.2 嘌呤霉素篩選轉染細胞 將轉染后的鴨BMECs接種24孔板（5×104個/孔），加入適量內皮細胞完全培養基孵育過夜。次日棄舊培養基，加入含嘌呤霉素（2 μg/mL）的篩選培養基適量，孵育過夜。重復上述步驟3～5 d，陰性對照細胞加入不含嘌呤霉素的完全培養基培養。待陰性對照細胞全部死亡后，將存活的陽性細胞轉至T25培養瓶中繼續培養。

2.4.3 永生化細胞系鑒定 挑選經嘌呤霉素轉染后生長狀況良好、形態穩定的陽性鴨BMECs進行傳代培養，連續傳代12代。選取P12鴨BMECs培養，分別對培養1 d、2 d、3 d的鴨BMECs進行免疫熒光染色，并在熒光倒置顯微鏡下觀察采集圖片信息，應用Image J 軟件分析熒光強度，進行統計分析。

3 結果

3.1 鴨原代BMECs分離培養和鑒定

按照2.1所述方法，成功從櫻桃谷鴨胚腦組織中分離出鴨BMECs，光學顯微鏡200×視野下可見細胞間融合成片，呈現典型單層、鋪路石樣鑲嵌式排列（圖1A）。經免疫熒光染色，觀察到細胞可特異表達鴨vWF，說明成功分離并培養出鴨原代BMECs（圖1B）。

圖1 原代鴨BMECs的鑒定

3.2 鴨BMECs永生化細胞系培養和鑒定

挑選經嘌呤霉素轉染后生長狀況良好、形態穩定的陽性鴨BMECs進行傳代培養，連續傳代12代，細胞增殖一直比較旺盛，沒有生長停滯。P12鴨BMECs如圖2A所示，可見細胞生長狀況極好，細胞間隙變小，胞質緊密連接。對P12鴨BMECs進行免疫熒光染色，細胞質呈現綠色熒光，vWF相關抗原陽性表達（圖2B）。以上結果說明永生化鴨BMECs細胞系培養成功。

P12鴨BMECs培養1 d、2 d、3 d后進行免疫熒光染色，結果顯示vWF陽性表達（圖3A），應用Image J軟件分析熒光強度，繪制統計圖。隨著培養天數的增加，vWF表達差異不顯著，vWF在不同培養天數P12鴨BMECs中穩定表達（圖3B）。

圖3 P12鴨BMECs培養1 d、2 d、3 d鑒定結果

4 分析討論

鴨疫里默氏桿菌可突破鴨BBB進入腦組織，導致鴨腦膜炎[4]，目前對該菌突破BBB的機制知之甚少。對這一機制開展研究，首先要建立鴨BBB的體外細胞模型。

腦微血管內皮細胞（BMECs）、星形膠質細胞、周細胞和基膜等共同構成BBB，而BMECs是構成BBB最主要的細胞，永生化的BMECs可作為BBB的體外細胞模型，目前已用于多種病原突破BBB的機制研究[5-7]。BMECs具有外周血管內皮細胞的典型特點，內皮細胞是一種單層扁平上皮，呈多邊形，細胞邊緣呈鋸齒狀，相互嵌合，形成了完整的血管內膜結構。目前，不同研究人員已經針對人以及小鼠、大鼠、家兔和豬等多種動物的BMECs建立了體外分離培養方法和BBB模型[8-11]。

分離出鴨BMECs并在離體環境下培養是體外建立BBB模型的前提條件。由于分離細胞的生理狀態不同，不同批次的細胞之間可能存在差異以及存在海弗利克極限（Hayflick limit），不能為后續研究提供穩定的BBB模型，因此需構建鴨BMECs的永生化細胞系。目前，人們已建立了多種細胞永生化的方法，包括：（1）端粒酶激活細胞永生化[12]。端粒酶能以自身的RNA為模板，延伸端粒或合成新的端粒DNA來維持端粒長度，使細胞不會出現凋亡，從而實現細胞永生化。（2）癌基因法[13]。一些原癌基因，如Myc66[14]、c-Jun[15]、vsrc和Mdm2[16]，通過基因轉染可介導目的細胞永生化。c-Myc轉錄表達的蛋白通過誘導端粒酶mRNA快速表達，直接激活端粒酶活性，促進細胞進入永生化[14]。（3）病毒轉染。很多病毒感染能夠誘導細胞永生化，例如EB病毒[17]、人乳頭瘤病毒（HPV）[18]和猿猴病毒40（SV40）[19]。這些病毒感染其天然宿主細胞，能誘導細胞永生化。本研究選用SV40病毒轉染原代鴨BMECs，然后利用含嘌呤霉素的內皮細胞完全培養基篩選轉染后的鴨BMECs，能夠存活并生長的細胞即為陽性篩選株，挑取陽性株細胞繼續進行傳代培養，并隨時觀察細胞形態。傳代培養第12代細胞生長狀態良好，在細胞瓶中單層致密生長，細胞呈梭形鑲嵌排列，細胞間隙小，保持著原代BMECs的生長特性。

免疫熒光染色[20-21]是一種適用于鑒定細胞的檢測方法，依據抗原抗體反應和化學顯色的原理，采用標記的特異性抗體對組織或細胞內抗原的分布進行原位檢測。將培養處理后的細胞爬片固定、破膜、封閉后，加入一抗與抗原結合，再加入標記有熒光素的二抗與一抗進行反應，最后通過激光共聚焦掃描顯微鏡進行熒光拍攝來顯示細胞中靶蛋白的表達變化和定位[22]。血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）主要由血管的內皮細胞產生，可作為一抗的特異性識別位點來識別內皮細胞，再通過帶有免疫熒光的二抗與之結合，從而鑒定待測細胞是否是血管內皮細胞。本試驗針對細胞核和vWF進行免疫熒光染色，染色結果通過Image J[23]軟件分析熒光強度，并利用Graphpad軟件繪制統計圖。結果顯示，原代鴨BMECs以及轉染成功后傳代培養的P12 BMECs均在胞質中出現綠色熒光，即vWF相關抗原陽性表達，且表達差異不顯著，說明鴨原代和永生化BMECs培養成功。

本試驗從鴨胚腦組織中分離和體外培養原代鴨BMECs，并通過免疫熒光染色技術對其進行鑒定。同時將SV40過表達慢病毒載體轉染鴨原代BMECs，篩選陽性表達株后進行傳代培養12代以上，建立了永生化細胞系。