甘肅省部分地區(qū)養(yǎng)殖場飼料中玉米赤霉烯酮的檢測及分析

馬 甜，李宗帥，張啟冉，趙興緒,3，張 勇,3*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省動物生殖生理及繁殖調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070 ；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

霉菌毒素（mycotoxins）主要指霉菌在其所污染的食品中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，是最常見的低分子量食品污染物之一[1]。霉菌毒素可在農(nóng)作物大田收獲時(shí)形成，貯存條件不適宜，高溫、干旱和潮濕的環(huán)境均可促進(jìn)作物中霉菌毒素的產(chǎn)生和生長。這些常見毒素會在生產(chǎn)、收獲、儲存和加工的不同階段通過食物鏈進(jìn)入動物體和人體內(nèi)，對機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害，如機(jī)體急性、中度或慢性中毒，損害肝腎健康，甚至危害其他組織等[2]。玉米赤霉烯酮（ZEA）是由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的一種具有免疫毒性、肝毒性和異種效應(yīng)的真菌毒素[3]，對多種生物均具有雌激素樣作用[4]。ZEA經(jīng)常出現(xiàn)在以谷物為基礎(chǔ)的產(chǎn)品中，如小麥、高粱、玉米青貯飼料、大豆、啤酒和玉米油等[5-6]，這些被污染的農(nóng)產(chǎn)品不僅會對動物和人類造成危害，而且會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對ZEA污染的各種生物液體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ZEA會通過食物攜帶一同被攝入體內(nèi)，機(jī)體吸收毒素及其代謝物后，ZEA循環(huán)于動物或人類血液、尿液和牛奶（包括女性母乳）等生物液體中[7]。Mauro等的研究表明，ZEA存在于肥胖婦女的血清中，正常體重女性身體中ZEA水平較低，這一結(jié)果闡明ZEA的存在可能與肉類攝入和身體質(zhì)量指數(shù)有關(guān)[8]。在肝臟中，ZEA誘導(dǎo)組織發(fā)生病變，進(jìn)而發(fā)展為肝癌[9]。Rai等[10]認(rèn)為，肝臟是ZEA分布的主要器官，在肝損傷的情況下，ZEA可引起血清轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素水平升高。農(nóng)業(yè)是我國國民經(jīng)濟(jì)的基礎(chǔ)，而畜牧業(yè)是我國農(nóng)業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)，畜牧業(yè)的健康發(fā)展對我國人民的生活水平、農(nóng)牧民的收入來源以及人們的健康至關(guān)重要。我國規(guī)定飼料及其產(chǎn)品中ZEA的限量為0.1～1.5 mg/kg[11]，人食用的糧食中ZEA含量不能超過60 μg/kg[12]。長期以來，人們對霉菌毒素缺乏正確的認(rèn)識，忽視了食品和飼料中霉菌毒素的毒性作用，這對畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和人類的健康構(gòu)成威脅，會造成不可彌補(bǔ)的危害。因此，嚴(yán)格控制飼料中ZEA的含量對動物的健康養(yǎng)殖和人類的健康生活都非常重要。本文采用高效液相色譜法以及玉米赤霉烯酮快速檢測試紙2種方法對飼料中ZEA的含量進(jìn)行檢測，對比2種檢測方法所得結(jié)果，從而了解甘肅定西、張掖等地養(yǎng)殖場飼料中ZEA的污染狀況及程度，為廣大養(yǎng)殖戶制定科學(xué)有效的飼料貯存措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑 在甘肅通渭、臨洮、永昌、張掖4個(gè)市（縣）不同養(yǎng)殖場隨機(jī)采集飼料樣品共計(jì)48份，包括玉米、麩皮、豆粕、精料及玉米秸稈青貯飼料等。玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）、甲醇（純度≥99.5%）、乙腈（純度≥99.9%）、超純水。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 YP1002N電子天平（上海精科有限公司）、F120型粉碎機(jī)（北京永光明醫(yī)療儀器廠）、KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山舒美超聲儀器有限公司）、RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州儀器有限公司）、YLD-2000恒溫干燥箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司）、Agilent 1290超高效液相色譜儀（FLD檢測器）、濾器（0.22 μm）、玻璃進(jìn)樣瓶（2 mL）、離心管。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜法檢測飼料中的玉米赤霉烯酮

1.2.1.1 樣品提取。稱取100 g飼料樣品于恒溫干燥箱中過夜烘干，粉碎成末，稱取25 g置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL 90%乙腈充分振蕩，置于超聲波清洗儀10 min（溫度55 ℃，頻率60 Hz），抽提50 mL濾液濃縮蒸發(fā)至干燥（溫度55 ℃，60 r/min），甲醇溶解，置于恒溫干燥箱烘干，再次溶解，0.22 μm濾膜過濾樣品，吸入玻璃進(jìn)樣瓶待測。

1.2.1.2 色譜條件。色譜柱：Agilent XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m）；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇，溶液體積分?jǐn)?shù)為70%，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL；熒光檢測器：激發(fā)波長為274 nm，發(fā)射波長為440 nm。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線。ZEA標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇分別稀釋至50 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL，進(jìn)樣量為20 μL，根據(jù)濃度與峰面積的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立一元線性回歸方程，其中X為ZEA的濃度，Y為峰面積。

1.2.2 快速試紙條檢測飼料中玉米赤霉烯酮

1.2.2.1 樣品處理。粉碎飼料樣品，稱取1 g于4 mL離心管中，加入2 mL樣品提取液（70%甲醇-單蒸水）振蕩15 min，靜置2～5 min，25 μL上清液與100 μL樣品稀釋液（PBST）混勻，進(jìn)行試紙檢測。

1.2.2.2 試紙檢測。水平放置檢測卡，取待檢溶液100 μL，置于試紙條加樣孔，靜置5～10 min，判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 ZEA高效液相色譜圖

按照以上方法，測得ZEA標(biāo)準(zhǔn)品和飼料樣品的液相色譜圖（圖1、圖2），其中橫坐標(biāo)代表時(shí)間，縱坐標(biāo)代表峰高。由圖1、圖2可知，待測樣品出峰時(shí)間10 min左右，且峰形良好。

圖1 ZEA標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 飼料樣品色譜圖

2.2 ZEA標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)濃度與峰面積的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），建立一元線性回歸方程：Y=0.089 8X+0.491 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 3，其中X為ZEA的濃度（ng/mL），Y為峰面積。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，ZEA在50～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3 ZEA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 不同地區(qū)養(yǎng)殖場飼料中玉米赤霉烯酮檢測情況

不同地區(qū)6個(gè)養(yǎng)殖場隨機(jī)采集的飼料中ZEA檢出結(jié)果見表1。ZEA的總檢出率為75.00%，其中21份飼料中ZEA含量超出國家標(biāo)準(zhǔn)（500 μg/kg），12份飼料未測出ZEA。

表1 飼料中ZEA檢測結(jié)果

將所測結(jié)果根據(jù)地區(qū)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，不同地區(qū)養(yǎng)殖場飼料中的ZEA檢測結(jié)果如圖4、圖5所示。所采集樣品地區(qū)中，張掖市ZEA檢測陽性率最高，為50.00%，其次為定西地區(qū)2個(gè)縣，分別為臨洮縣45.45%、通渭縣44.44%。

圖4 不同地區(qū)ZEA檢測結(jié)果

圖5 不同地區(qū)ZEA檢測陽性率

將所測結(jié)果根據(jù)飼料種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，不同種類飼料中ZEA檢測結(jié)果如圖6、圖7所示。所檢測飼料中，玉米及其副產(chǎn)品受ZEA污染率最高，為72.73%，其次為微貯飼料及精料，其他原料如麩皮等均檢測出ZEA污染。

圖6 不同種類飼料ZEA檢測結(jié)果

圖7 不同飼料ZEA檢測陽性率

2.4 高效液相色譜法及試紙條法檢測ZEA結(jié)果比較

隨機(jī)抽取12種飼料樣品，包括玉米、豆粕、精飼料等，使用玉米赤霉烯酮快速檢測試紙條對飼料樣品進(jìn)行檢測，通過對比發(fā)現(xiàn)所得結(jié)果與高效液相色譜法所測結(jié)果一致。其中9種飼料檢測結(jié)果為陰性（ZEA≤500 μg/kg），3種飼料檢測結(jié)果為陽性（ZEA＞500 μg/kg）。

3 討論

目前，測定糧食類食品和飼料中玉米赤霉烯酮的方法主要有薄層色譜法（Thin layer chromatography，TLC）[13]、氣相色譜法（Gas chromatography，GC）、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）、免疫化學(xué)檢測法[14]和生物傳感器法[15]等，其中最常用的方法是高效液相色譜法。薄層色譜法、氣相色譜法對儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)人員操作技術(shù)要求較高[16]，高效液相色譜法是目前國內(nèi)外公認(rèn)的、權(quán)威的一種檢測真菌毒素的方法[17]，但所需的設(shè)備價(jià)格高昂，檢測過程繁瑣，因此不適合養(yǎng)殖場和飼料廠等基層使用[18]。快速試紙條檢測法所需時(shí)間較短，僅憑肉眼觀察即可檢測出樣品中ZEA含量是否超標(biāo)，可適用于基層檢測，缺點(diǎn)是無法檢測出超標(biāo)ZEA的具體含量，對于青貯草和黃貯草等吸水性較強(qiáng)的飼料無法檢測[19]。因此，快速、準(zhǔn)確和簡便檢測ZEA的方法對養(yǎng)殖場檢測人員而言尤為重要。

本試驗(yàn)使用高效液相色譜法和試紙條法檢測甘肅省不同地區(qū)養(yǎng)殖場飼料中玉米赤霉烯酮的含量，結(jié)果表明，6個(gè)養(yǎng)殖場采集的48份飼料中，21份ZEA含量超出國家標(biāo)準(zhǔn)（500 μg/kg），12份未檢測出ZEA，ZEA的總檢出率為75.00%。檢測超標(biāo)的飼料樣品中，8份均為玉米或其副產(chǎn)品，7份為微貯飼料，其余為其他原料。根據(jù)這些養(yǎng)殖場所處地區(qū)環(huán)境及飼料貯存條件探究其原因可能有以下幾點(diǎn)：一是部分養(yǎng)殖場飼料存放倉庫較為簡易，尤其張掖、定西等地夏季氣溫較高，高溫環(huán)境不利于飼料貯存，易導(dǎo)致霉菌污染；二是采樣過程中發(fā)現(xiàn)，有些養(yǎng)殖場所存放飼料的袋口未密封，易受潮滋生霉菌，有些需要密封貯存的微貯飼料未進(jìn)行有效密封；三是玉米等在碾碎加工過程中會產(chǎn)生大量熱量，樣品采集過程中發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖場未經(jīng)攤晾便將碾碎的玉米集中堆放于倉庫中，導(dǎo)致熱量無法散出，從而受到污染。目前，對于ZEA中毒基本無有效的解毒藥。針對ZEA污染飼料的防控，可以根據(jù)不同的飼料種類完善貯存方法，定期檢測并銷毀污染源。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果和不同飼料的物理特性，對養(yǎng)殖場飼料的貯存提出以下幾點(diǎn)建議：第一，從源頭控制，選擇優(yōu)質(zhì)飼料原料。在飼喂過程中，玉米和豆粕等易受污染的原料占比較多。因此，選擇優(yōu)質(zhì)原料可以減少霉菌的產(chǎn)生。第二，改善飼料的貯存方法。科學(xué)的貯存方法可以避免飼料霉?fàn)€變質(zhì)，減少飼料營養(yǎng)成分損失，從而有效提高飼料的利用價(jià)值和養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)效益[20]。存放飼料的空間盡量保持通風(fēng)干燥，避免下雨受潮；若為堆疊放置的飼料，可在底部鋪上木板或其他材料以防霉變。第三，控制飼料的貯存時(shí)間。養(yǎng)殖場所購買存放的飼料應(yīng)在有效期限內(nèi)盡快使用，防止因放置過久而霉變。辛明等[21]對牛羊顆粒飼料進(jìn)行了相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)檢測，結(jié)果表明，貯存時(shí)間延長，飼料中的霉菌數(shù)呈上升趨勢，貯存時(shí)間為60 d以內(nèi)時(shí)，飼料各項(xiàng)指標(biāo)均表現(xiàn)優(yōu)異。第四，控制水分及濕度。有數(shù)據(jù)表明，常溫倉庫內(nèi)貯存飼料時(shí)要求空氣的相對濕度在70%以下，飼料的水分含量不超過12%，以便延長飼料貯存時(shí)間[22]。陳保君等[23]測定了在高溫條件下溫度對不同含水量飼料的影響，結(jié)果表明，在高溫環(huán)境下，飼料中營養(yǎng)成分發(fā)生變化，水分和溫度對飼料有顯著影響（P＜0.05）。第五，應(yīng)用物理或化學(xué)法防霉除菌。在飼料中添加脫霉劑、抗氧化劑等，以便延長飼料貯存時(shí)間[24]。第六，建議養(yǎng)殖場根據(jù)實(shí)際情況，定期對所購進(jìn)或生產(chǎn)的飼料及其原料進(jìn)行檢測，防止陳玉米等劣質(zhì)原料的使用所帶來的危害。

4 結(jié)論

所采集的樣品中，ZEA的總檢出率為75.00%，其中玉米及其副產(chǎn)品所受ZEA污染最嚴(yán)重，其次為微貯飼料及精料。科學(xué)正確的飼料貯存方法對養(yǎng)殖場的發(fā)展至關(guān)重要，飼料質(zhì)量無法提高，畜禽健康就無法保障，進(jìn)而影響肉制品品質(zhì)，危害人類的健康。建議養(yǎng)殖場在采購飼料、飼料原料及存放飼料時(shí)，多注意存儲方法及控制污染源頭，并在日常管理工作中定期檢測飼料中霉菌毒素的污染情況，防止霉菌毒素對養(yǎng)殖場造成危害。