CD276在泛癌中的免疫表達(dá)及預(yù)后

張癸乾，王寧，榮耀，唐明政，蔡輝

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院臨床普外中心，蘭州 730000；3.國(guó)家衛(wèi)生健康委胃腸腫瘤診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省人民醫(yī)院，蘭州 730000；4.甘肅省外科腫瘤分子診斷與精準(zhǔn)治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省人民醫(yī)院，蘭州 730000）

癌癥在大多數(shù)國(guó)家是70歲以下人群主要或次要的死亡原因［1］，由于存在藥物耐受性和癌癥復(fù)發(fā)等問題，患者的生存率低［2］。泛癌分析可以用來區(qū)分人類惡性腫瘤的特征，為臨床治療提供新思路。

CD276（B7-H3）是B7超家族的分子之一，該基因所編碼的蛋白屬于免疫球蛋白家族［3］，參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［4］。CD276被認(rèn)為是T細(xì)胞的刺激蛋白，但許多研究［5］表明，CD276作為T細(xì)胞的抑制因子，能夠促進(jìn)腫瘤的侵襲和增殖，CD276與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附有關(guān)。盡管該基因的轉(zhuǎn)錄本在正常組織和實(shí)體瘤中都很常見，但該蛋白只在腫瘤組織中優(yōu)先表達(dá)［6］。因此，本研究綜合分析了泛癌中CD276的表達(dá)水平，旨在探究CD276與腫瘤預(yù)后及免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性，從而為癌癥治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 樣本數(shù)據(jù)收集

通過癌癥基因組圖譜（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載臨床數(shù)據(jù)。通過UCSC Xena（https：//xena.ucsc.edu/）從TCGA數(shù)據(jù)庫下載33種不同癌癥類型的信息。通過GTEx（https：//gtexportal.org/）下載來自449例健康捐贈(zèng)者的7 000余份樣本，涵蓋44種組織。

1.2 CD276在泛癌中的表達(dá)及預(yù)后分析

從TCGA數(shù)據(jù)集（https：//portal.gdc.com）下載了泛癌的RNA測(cè)序表達(dá)（3級(jí)）譜和相應(yīng)的臨床信息。總生存期（overall survival，OS）、疾病特異性生存期（disease specific survival，DSS）、無病生存期（disease-free survival，DFS）和無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）用來研究CD276表達(dá)與患者生存之間的關(guān)系。以CD276表達(dá)水平的中位數(shù)為閾值，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。采用R語言survival和survminer包來顯示患者的生存情況。

1.3 CD276與腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）、腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）相關(guān)性分析

利用R語言ggplot2、ggpubr和 ggExtra包來分析CD276表達(dá)和TME之間的相關(guān)性（以相關(guān)系數(shù)|r|＞0.2且P＜0.001為標(biāo)準(zhǔn)）。TMB、MSI和CD276表達(dá)之間的相關(guān)性用Spearman方法計(jì)算。R語言fmsb包用于圖像可視化。

1.4 CD276與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性分析

采用CIBERSORT評(píng)估泛癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況。R軟件包 “ggplot2”“ggpubr”和 “ggExtra”被用來分析CD276表達(dá)和細(xì)胞免疫浸潤(rùn)之間的相關(guān)性（以相關(guān)系數(shù)|r|＞0.2且P＜0.001為標(biāo)準(zhǔn)）。為了獲得可靠的免疫評(píng)分，使用R語言immuneeconv包［7］。

1.5 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

GSEA（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads.jsp）提供了基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）的基因集。使用R語言limma、org.Hs.eg.db、clusterProfiler和 enrichplot包對(duì)GO和KEGG進(jìn)行功能注釋和路徑富集分析。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)時(shí)PCR

胃癌細(xì)胞（HGC-27、MGC-803和MKN-45）和正常細(xì)胞（GES-1），結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116、SW620和SW480）及正常細(xì)胞（NCM460）來自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞資源中心。用含有10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。

采用TRIzol法從細(xì)胞中分別提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將純化的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，然后對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，最后用2-ΔΔCt法計(jì)算CD276的相對(duì)表達(dá)量，并以GAPDH為內(nèi)參照。CD276引物序列，正向，5’-TCACTGCAAAGATTTAC CATCAGC-3’，反向，5’-TGTCTTGGAGCCTTCTCCC-3’。GAPDH引物序列，正向，5’-GGAAGCTTGTCATCAA TGGAAATC-3’，反向，5’-TGATGACCCTTGGCTCCC-3’。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有基因數(shù)據(jù)都通過對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換進(jìn)行歸一化。CD276的差異表達(dá)采用Wilcox測(cè)試檢測(cè)。數(shù)據(jù)的可視化由R語言（4.1.1版）處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD276在泛癌中高表達(dá)

利用TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫研究了CD276在不同腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，CD276在腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma，ACC）、膀胱癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）和乳腺癌（breast invasive carcinoma，BRCA）等腫瘤中均高表達(dá)，見圖1。

圖1 CD276在泛癌中的表達(dá)Fig.1 CD276 expression in pan-cancer

2.2 CD276對(duì)泛癌預(yù)后的影響

生存分析結(jié)果顯示，在ACC、BLCA和結(jié)腸癌（colon adenocarcinoma，COAD）等腫瘤患者中，CD276的高表達(dá)與不良OS和DSS相關(guān)（圖2A、2B）；在ACC、BLCA和低度膠質(zhì)瘤（lower grade glioma，LGG）等腫瘤中，CD276的高表達(dá)與低PFS相關(guān)，但在大B細(xì)胞淋巴瘤（large B-cell lymphoma，DLBC）中則相反（圖2C）；在ACC、宮頸癌（cervical cancer，CESC）和膽管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）等腫瘤中CD276的高表達(dá)與不良DFS有關(guān)（圖2D）。

2.3 CD276在TME、TMB和MSI中的作用

TME通過刺激腫瘤細(xì)胞間的異質(zhì)性并使其具有多藥耐藥性來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，在BLCA、COAD和LGG等腫瘤中，CD276的表達(dá)與基質(zhì)細(xì)胞（圖3A）和免疫細(xì)胞（圖3B）得分呈正相關(guān)，說明基質(zhì)細(xì)胞或免疫細(xì)胞的含量隨著CD276表達(dá)水平的提高而增加。TMB是指100萬個(gè)堿基中的堿基突變率。MSI是指與正常組織相比，由于基因的插入或缺失而在腫瘤的微衛(wèi)星位點(diǎn)出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因的現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，在ACC、BRCA和CESC等腫瘤中，CD276與TMB之間有明顯的關(guān)聯(lián)（圖3C）；在COAD、急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，LAML）、直腸癌（rectal cancer，READ）和睪丸癌（testicular cancer，TGCT）中，CD276與MSI之間有明顯的關(guān)聯(lián)（圖3D）。

2.4 CD276與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

采用CIBERSORT算法研究CD276表達(dá)與22種免疫相關(guān)細(xì)胞的浸潤(rùn)水平之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，CD276與不同癌癥的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)（圖4）。CD276的表達(dá)與免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)密切相關(guān)，從而解釋了患者生存率的差異。

2.5 GSEA結(jié)果

為了驗(yàn)證CD276在泛癌中的生物學(xué)功能，采用R語言對(duì)其進(jìn)行了GSEA。結(jié)果表明CD276主要富集在抗原處理和遞呈、細(xì)胞膜感應(yīng)通路、免疫移植物抗宿主病、類似I型受體的信號(hào)傳導(dǎo)途徑等（圖5）。

2.6 驗(yàn)證CD276在泛癌中的表達(dá)

分別使用胃癌和結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)CD276在泛癌中的表達(dá)做了實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)mRNA驗(yàn)證。結(jié)果表明CD276在胃癌和結(jié)腸癌中均呈高表達(dá)（圖6）。

圖6 體外驗(yàn)證CD276的表達(dá)Fig.6 In vitro validation of CD276 expression

3 討論

本研究探討了CD276在泛癌中的表達(dá)、預(yù)后以及CD276與TME、TMB、MSI和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系。利用GSEA富集了CD276在泛癌中的相關(guān)通路，并對(duì)CD276在泛癌中的表達(dá)進(jìn)行了體外實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)mRNA驗(yàn)證。

TME對(duì)免疫系統(tǒng)識(shí)別和介導(dǎo)自發(fā)性惡性腫瘤有很大影響。本研究結(jié)果顯示，間質(zhì)細(xì)胞或免疫細(xì)胞的數(shù)量隨著CD276表達(dá)水平的提高而增加。CD276是一種與免疫有關(guān)的分子，能增強(qiáng)癌癥的進(jìn)展。研究［8］表明，CD276能阻斷免疫細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞分化。Treg誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-10的表達(dá)和CD276在樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）中的表達(dá)，這使得DC具有免疫抑制性。接觸Treg后，DC使CD276上調(diào)，MHC肽復(fù)合物的數(shù)量減少，導(dǎo)致T細(xì)胞刺激受損。因此，CD276在介導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)DC的抑制起著關(guān)鍵作用。CD276對(duì)αβ T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞都有抑制作用，但其調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。CD276上調(diào)TAMs促進(jìn)腫瘤M2極化和CAFs的侵襲和遷移。此外，CD276還與PI3K/AKT、NF-KB、Ras/Raf/MEK/MAPK、JAK2/STAT3和葡萄糖代謝信號(hào)通路有關(guān)［8］。

CD276是一個(gè)免疫家族相關(guān)的基因，其在免疫方面具有重要的作用。利用CIBERSORT算法研究了CD276表達(dá)與22種免疫相關(guān)細(xì)胞的浸潤(rùn)水平之間的關(guān)系［9］。結(jié)果顯示，CD276參與了22種免疫相關(guān)細(xì)胞在各種癌癥中的表達(dá)，其進(jìn)一步說明了CD276在免疫方面對(duì)癌癥的進(jìn)展有重要影響。梁嘉瑜等［10］發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)因子CD276是腎上腺皮質(zhì)癌的個(gè)體預(yù)后和潛在治療目標(biāo)。CD276嵌合抗原受體T細(xì)胞可以成為治療某些致命性或難治性小兒惡性腫瘤患者的治療選擇［11］。CD276廣泛存在于各個(gè)系統(tǒng)的腫瘤中，在所有階段的尿路內(nèi)皮癌細(xì)胞中都明顯升高。CD276在正常尿路內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)減少可能意味著這些細(xì)胞將受到CD276介導(dǎo)的免疫療法的保護(hù)［12］。

雖然本研究對(duì)于CD276的泛癌研究結(jié)合了多個(gè)數(shù)據(jù)庫中的信息，但仍具有局限性。本研究仍停留在理論層面上，且得到的分析結(jié)果可能存在系統(tǒng)誤差，仍需通過研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，CD276的表達(dá)水平與多種腫瘤的預(yù)后有關(guān)，且與腫瘤中不同程度的免疫浸潤(rùn)有關(guān)，進(jìn)一步揭示了CD276作為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)生物標(biāo)志物的潛力。