基于網絡藥理學和分子對接技術探究鹽地堿蓬抗乳腺癌的機制

凌存保 趙小芳 樊偉平 陳文艷 杜欣娜

【摘要】 目的 應用網絡藥理學方法和分子對接技術探討鹽地堿蓬的活性成分對于乳腺癌輔助治療的潛在機制。方法 通過文獻研究結合中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）篩選出鹽地堿蓬的主要藥效成分，通過SwissTargetPrediction數據庫對藥效成分的靶標進行預測。同時，通過查詢GeneCards網站和DisGeNet數據庫得到乳腺癌的相關靶點。將藥物和疾病的靶點進行匹配，得到共同靶點列表，之后將列表導入STRING在線分析平臺，構建分子靶點蛋白之間的互作網絡，利用cytoscape3.8.0軟件進行可視化并篩選核心靶點。通過R軟件進行基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，運用AutoDock Vina和Pymol將有效成分與核心靶標進行分子對接。結果 鹽地堿蓬主要的藥效成分有3種，與乳腺癌相關的靶點有179個。GO分析顯示靶點主要集中在上皮細胞增殖的調控、氧化應激反應、ERK1和ERK2下游信號通路等。KEGG分析得到富集通路主要是與腫瘤發生發展相關的通路，如MAPK信號通路、內分泌抵抗信號通路、乳腺癌信號通路等。分子對接顯示3種活性成分與關鍵靶點具有較好結和力。結論 鹽地堿蓬的主要活性成分可能通過多靶點調節多條信號通路輔助干預乳腺癌。本研究可為后期抗腫瘤藥物開發提供參考。

【關鍵詞】 鹽地堿蓬；活性成分；網絡藥理學；乳腺癌；分子對接

Systematic elucidation of the pharmacological mechanisms of Suaeda salsa for treating breast cancer via network pharmacology

Ling Cunbao，Zhao Xiaofang，Fan Weiping，Chen Wenyan，Du Xinna. Jiangsu Vocational College of Medicine，Yancheng，Jiangsu 224005

【Abstract】 Objective To uncover the potential effective components and mechanism of Suaeda salsa in the treatment of breast cancer based on network pharmacology. Methods The effective components of Suaeda salsa were retrieved from other articles and screened by tcmsp. The corresponding targets of the effective components were collected from the SwissTargetPrediction website. Targets of breast cancer were collected from GeneCards and DisGeNet databases. The intersection of Suaeda salsa target genes and breast cancer target genes was performed using the “VennDiagram” package in R software. Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analyses of the targets were performed via R software. Cytoscape software was used to construct a compound network. A protein-protein interaction （PPI） network was generated by using the STRING database. Key targets were filtered by utilizing the CytoNCA plugin. Molecular docking analysis was used to check the affinity of active ingredients to the central targets. Results The results revealed that there were 3 active compounds of Suaeda salsa which have 179 targets associated with breast cancer. GO analysis suggested that these targets were significantly enriched in factors associated with regulation of epithelial cell proliferation， oxidative stress and ERK1 and ERK2 cascade， etc. KEGG pathways mainly involved cancer-related pathways such as the MAPK signaling pathway and endocrine resistance and breast cancer. The results of molecular docking showed that the active compounds had a high affinity with the core targets. Conclusion The present study demonstrates that Suaeda salsa exerts therapeutic effects in breast cancer through multiple targets and pathways and provides evidence to support its potential development as a promising Chinese medicine.

【Key Words】 Suaeda salsa； Active ingredient； Network pharmacology； Breast cancer； Molecular docking

中圖分類號：R737.9? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1672-1721（2023）34-0001-06

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.34.001

由于人類生存環境的變化、生活習慣的改變和社會壓力的增大，近年來乳腺癌發病率逐年增加，且乳腺癌呈現出發病年輕化趨勢，嚴重影響人類的身心健康，甚至危及患者生命[1]。乳腺癌藥物治療主要包括化療、生物治療和內分泌治療[2]。許多藥物在治療腫瘤的同時也不可避免帶來不良反應，包括骨髓抑制和免疫功能低下、心臟損傷等[3]。近幾年開發出一些乳腺癌靶向治療的藥物，取得較好的療效，但由于腫瘤細胞的異質性，很多患者會產生耐藥性[4]。因此，研究高效、安全的新型抗腫瘤藥物已成為當今藥物研發的重要方向，來自于天然植物的活性成分的醫學價值也逐漸被人們認識。

鹽地堿蓬是一年生藜科植物，又名鹽蒿菜、鹽蓬，在我國主要分布于沿海海灘的沙地和鹽堿地。鹽地堿蓬中含有豐富的生物堿、黃酮、蛋白質、酚醌、多糖類等化合物，具有很多藥用價值，如降糖、抗感染、抗氧化、抗癌、防治心臟病、增強人體免疫力等[5]，但長期以來，鹽地堿蓬并未得到人們的重視，為更充分挖掘它的食用和藥用價值，故開展本研究。本研究通過中藥數據庫查詢、網絡藥理學、生物信息學技術分析鹽地堿蓬治療乳腺癌潛在靶點和機制，為治療乳腺癌提供理論基礎，為藥物開發提供參考。

1 資料和方法

1.1 鹽地堿蓬的活性成分和相應靶點篩選 通過文獻調查，得到鹽地堿蓬的主要活性成分。登錄中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（ TCMSP）查詢各活性成分的藥代動力學特性。篩選出口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的活性成分。從PubChem網站（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性成分的2D分子結構圖，并以標準延遲格式（standard delay format，SDF）保存。在SwissTargetPrediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）上傳活性成分的2D結構SDF文件，根據化學結構獲得預測靶點。隨后使用UniProtKB數據庫（https：//www.uniprot.org/）將靶點名轉換為相應的基因名稱。

1.2 乳腺癌相關的基因和治療靶點 以“breast cancer”為檢索關鍵詞從GeneCards網站（https：//www.genecards.org/）和DisGeNet數據庫（https：//www.disgenet.org/search）獲取乳腺癌的相關的靶基因列表。登錄UniProtKB數據庫，物種選擇“Homo sapiens”，對上述所有目標的基因名稱進行標準化。使用R軟件的“VennDiagram”包（Windows的3.6.0版本）將鹽地堿蓬靶基因和乳腺癌靶基因取交集，生成一個維恩圖和基因列表。

1.3 GO分析和KEGG富集通路分析 獲取重疊靶基因列表后，使用R語言的clusterprofiler包進行GO和KEGG通路富集分析，并進行可視化。GO富集分析包括了生物過程（bioprocess，BP）、細胞成分（cell composition，CC）和分子功能（molecular function，MF），以錯誤發現率（false discovery rate，FDR）校正的P值<0.05為差異有統計學意義，結果以柱形圖展示。此外，根據富集到某通路里靶基因占總基因比例排名和P值大小，篩選前20個關鍵的KEGG信號通路（P<0.01為差異有統計學意義），結果以氣泡圖展示。

1.4 構建藥物-成分-疾病-靶點-通路網絡 為了更清晰直觀表示鹽地堿蓬治療乳腺癌的多成分、多靶點和多通路機制，使用cytoscape3.8.0軟件構建藥物-成分-疾病-靶點-通路復合網絡。用不同顏色和形狀的節點分別代表藥物、成分、疾病、靶基因或相關信號通路。

1.5 構建蛋白-蛋白相互作用網絡（protein-

protein interactions，PPIs）并篩選核心靶點 將獲取的靶基因列表導入到STRING數據庫（https：//string-db.org/）從而構建蛋白-蛋白相互作用網絡（PPIs）。物種設置為人類，目標列表中保留綜合得分>0.9的PPIs進行進一步分析，下載TSV格式的蛋白相互作用文件，導入Cytoscape3.8.0軟件，進行可視化。節點和邊分別代表蛋白和蛋白之間的相互作用。不與網絡中其他蛋白質相互作用的孤立蛋白質被移除。利用CytoNCA插件計算各個節點蛋白質的3個關鍵拓撲學參數：度中心性（degree centrality，DC）、中間性中心性（betweeness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）。3個參數值都大于所有節點的中位數的蛋白質被認為有核心作用。

1.6 藥物主要成分和關鍵靶點的分子對接 從RSCB數據庫（http：//www.rcsb.org/）下載代表性核心蛋白的pdb結構式，使用AutoDock Tools軟件去除核心蛋白結構中水分子，再加氫，并計算電荷，保存為pdbqt格式。從PubChem數據庫獲取鹽地堿蓬3種活性成分的2D和3D結構的SDF文件。用Pymol軟件進行蛋白分子結構處理，上傳活性成分的小分子結構，接著使用AutoDock vina進行分子對接，計算結合能。結合能越小說明配體和受體結合越穩定，越可能發生相互作用。最后使用Pymol 2.4軟件（https：//pymol.org/2/）對所得對接結果進行可視化展示。

2 結果

2.1 鹽地堿蓬活性成分及靶點 按照方法1.1的步驟操作后，得到鹽地堿蓬所含符合口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18的活性成分共3個，包括胡蘿卜甾醇（daucosterol）、槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（β-sitosterol），相應的TCMSP編號和分子結構見表1、圖1、圖2、圖3。在pubmed數據庫下載3種活性成分的2D結構圖，上傳至swisstarget prediction數據庫，預測其作用靶點。結果顯示胡蘿卜甾醇的潛在作用靶點有100個，槲皮素的潛在作用靶點有100個，β-谷甾醇潛在作用靶點有38個。去除3組之間重復的靶點后，共得到209個靶點，提示鹽地堿蓬各成分之間的作用可能具有協同機制。

2.2 鹽地堿蓬和乳腺癌共同靶點 以“breast cancer”為檢索關鍵詞從DisGeNet數據庫和GeneCards網站分別獲取到乳腺癌的相關的靶基因766個和7 786個。用R軟件進行取交集操作后得到兩個數據庫共同的靶基因6 010個，見圖4（a）。這6 010個乳腺癌相關靶點和鹽地堿蓬的209個靶點之間的共同靶點有179個，結果以韋恩圖展示，見圖4（b）。

2.3 GO和KEGG通路分析結果 對得到的共同靶點用方法1.3進行GO和KEGG分析。GO分為生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）3類。富集到的生物學過程（BP）有1 810個，細胞組分（CC）共30個，分子功能（MF）共97個。根據P值從小到大排列，用柱形圖的形式分別展示富集效應最明顯的前10個GO條目，見圖5（a）。顯著富集的生物過程包括上皮細胞增殖（epithelial cell proliferation）、對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）、上皮細胞增殖的調控（regulation of epithelial cell proliferation）、氧化應激反應（response to oxidative stress）、ERK1和ERK2下游信號通路（ERK1 and ERK2 cascade）等。細胞組分主要包括膜脂質筏（membrane raft）、膜微區域（membrane microdomain）、RNA聚合酶II轉錄因子復合物（RNA polymerase II transcription factor complex）等。分子功能主要涉及磷酸化結合（phosphatase binding）、細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、蛋白激酶活性調控（protein phosphatase binding）等?？梢娀钚猿煞指深A乳腺癌可能與上皮細胞增殖、細胞因子受體結合通路有關。

KEGG信號通路富集分析共顯示富集到137個信號通路，以氣泡圖展示P值最小的20個信號通路，見圖5（b），主要包括癌癥相關的蛋白多糖信號通路，MAPK信號通路、癌癥中的microRNA信號通路、膀胱癌信號通路、內分泌抵抗信號通路、乳腺癌信號通路、TNF信號通路等。以上多條信號通路均與腫瘤發生發展相關，包括MAPK信號通路、microRNA信號通路、內分泌抵抗信號通路、乳腺癌信號通路、TNF信號通路等。鹽地堿蓬可能通過腫瘤發生發展相關信號通路發揮抗癌的功能。

2.4 構建藥物-成分-疾病-靶點-通路網絡 為了更清晰直觀表示鹽地堿蓬治療乳腺癌的潛在機制，用cytoscape軟件3.8.0構建藥物-成分-疾病-靶點-通路復合網絡，見圖6。結果表明鹽地堿蓬可能通過多靶點和多途徑對乳腺癌進行輔助治療。

2.5 構建PPI網絡并篩選核心靶點 將靶基因列表導入到STRING數據庫構建了蛋白-蛋白相互作用網絡（PPIs）。下載蛋白互作信息的TSV格式文件，導入Cytoscape3.8.0軟件進行可視化。不與網絡中其他節點相互作用的獨立蛋白質被移除，結果見圖7（a）。利用CytoNCA插件計算各個節點的3個關鍵拓撲學參數DC、BC、CC。3個參數值都大于所有節點的中位數的蛋白質被認為有核心作用。經過2次篩選，見圖7（b）（c）（d），得出網絡中的核心蛋白有21個，見圖7（e），主要包括AKT1、MAPK1、TP53、EGFR、CASP3等。

2.6 鹽地堿蓬活性成分與核心靶點的分子對接結果 分子對接結果顯示胡蘿卜甾醇、槲皮素、β-谷甾醇與代表性核心靶點MAPK1、EGFR結合力較好，結合能均小于-7 kJ/mol，結合構象比較穩定，見封三圖8（a）和圖8（c）、圖9（a）和圖9（c）、圖10（a）和圖10（c）。

計算機模擬發現胡蘿卜甾醇、槲皮素、β-谷甾醇主要通過氫鍵和疏水作用結合在目標蛋白的表面口袋中，見封三圖8（b）和圖8（d）、圖9（b）和圖9（d）、圖10（b）和圖10（d）。圖中，紫色表示靶蛋白，粉色表示蛋白與活性成分結合的氨基酸殘基，綠色表示活性成分，黃色虛線表示氫鍵。胡蘿卜甾醇可以與EGFR的第1位的天冬氨酸、第46位的亮氨酸殘基和61位的天冬酰胺形成穩定的氫鍵。槲皮素可以和MAPK1蛋白的31號異亮氨酸殘基、54位和114位的賴氨酸殘基、108號甲硫氨酸殘基、166位半胱氨酸殘基和107號天冬氨酸殘基結合。

3 討論

鹽地堿蓬是一種生存能力強、分布范圍廣的一年生草本植物，含有多種生物活性物質，具有很廣闊的開發前景。本研究論證了鹽地堿蓬中主要活性成分對乳腺癌的潛在治療作用。經過文獻調查和中藥TCMSP數據庫查詢，得出鹽地堿蓬中的槲皮素、胡蘿卜甾醇、β-谷甾醇是具有藥物活性的主要成分。

槲皮素屬于天然植物來源的黃酮類化合物，在鹽地堿蓬中的含量較高，對多種疾病具有治療和緩解功效，包括惡性腫瘤、心血管疾病、神經退行性疾病和氧化應激相關疾病[6-7]。在滿足一定的劑量和時間條件下，槲皮素具有抗氧化特性，使細胞的氧自由基和抗氧化物質達到平衡，抑制乳腺癌的發生發展[8]。本研究發現鹽地堿蓬對乳腺癌的靶點富集于氧化應激反應（response to oxidative stress）過程。槲皮素可以抑制Her-2介導的信號通路，從而減輕腫瘤細胞對他莫昔芬的耐藥性[9]。槲皮素通過促進Foxo3a信號蛋白及其上游蛋白（JNK）的活性來增加凋亡和細胞周期阻滯，從而抑制腫瘤的發生發展[10]。本研究發現鹽地堿蓬抗乳腺癌的靶點有部分富集于磷酸化途徑和蛋白激酶活性調節等，與信號蛋白激活有關。為了提高槲皮素的溶解度、生物利用度、循環時間和人體內的靶向性，科學家正致力于開發新型可生物降解和相容性載體作為給藥系統，包括基于脂質體、殼聚糖等[8]。

β-谷甾醇和胡蘿卜甾醇屬于天然植物來源的甾醇類化合物，在醫藥學上有很廣泛的使用。β-谷甾醇和胡蘿卜甾醇具有抗乳腺癌作用。細胞實驗和動物實驗表明胡蘿卜甾醇抑制了乳腺癌轉移，減少了轉移灶數量[11-12]，它通過ROS依賴性的方式誘導自噬，抑制癌細胞增殖，有望成為一種抗癌藥物[13]。本研究發現顯著富集的生物過程包括上皮細胞增殖、上皮細胞增殖的調控、ERK1和ERK2下游信號通路等，這些均與乳腺癌細胞的增殖轉移相關。β-谷甾醇具有抗腫瘤特性和癌癥治療潛力[14]。有文獻報道，β-谷甾醇對體外培養的乳腺癌細胞具有抗增殖和促凋亡作用，可以使乳腺癌細胞阻滯在G1期[15]。

對靶點的網絡拓撲學分析得出核心靶點有21種，主要包括AKT1、MAPK1、TP53、EGFR、CASP3等。以MAPK1和EGFR為例進行研究。有研究報道，MAPK1高表達和高磷酸化激活狀態促進了乳腺癌的發生和轉移[16]，與乳腺癌的轉移和預后不良有關[17]。MAPK1/3激酶促進ULK1降解，并促進乳腺癌骨轉移[18]。長非編碼RNA LINC00473作為一種競爭性內源性RNA，通過miR-198減少MAPK1的表達，達到抑制乳腺癌的效果[19]。EGF是一種表皮生長因子，與EGF受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的結合可促進細胞的存活和增殖。表皮生長因子受體（EGFR）在大多數三陰乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）中高表達，這可能為精準治療提供一個潛在的靶點。用釹、紫杉醇（paclitaxel，PTX）和西妥昔單抗（Cetuximab，Cet）結合制作納米復合物，可與EGFR特異性結合，進行靶向治療，可促進EGFR高表達TNBC的細胞凋亡和腫瘤生長抑制[20]。本研究通過分子對接可發現鹽地堿蓬的活性成分與乳腺癌關鍵靶點結合力較好。為鹽地堿蓬抗乳腺癌提供了線索和參考，有利于鹽地堿蓬藥用和食用價值的開發。為了進一步證明其功效，后面還需要更多分體外和體內實驗驗證。

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（收稿日期：2023-09-22）