夏天無調(diào)控成纖維細(xì)胞活性改善坐骨神經(jīng)痛的研究

黃善敏 鄭雪花 鄭士瑞 錢長暉（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州 3501；.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 福州 3501）

夏天無為罌粟科植物伏生紫堇的干燥塊莖，具有活血通絡(luò)、消炎鎮(zhèn)痛的功效［1］，在臨床上治療坐骨神經(jīng)痛［2-4］，但其具體作用機(jī)制并未明確。

前期研究發(fā)現(xiàn)夏天無能減輕坐骨神經(jīng)痛模型SD 大鼠疼痛，減少神經(jīng)腫脹程度，改善受損神經(jīng)區(qū)域微環(huán)境，減少巨噬細(xì)胞的應(yīng)答和膠原纖維數(shù)量［5-6］，但夏天無對成纖維細(xì)胞的應(yīng)答調(diào)控作用卻未加以研究。由于成纖維細(xì)胞是周圍神經(jīng)微環(huán)境中重要的結(jié)締組織性質(zhì)細(xì)胞，激活的成纖維細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，增強(qiáng)合成和分泌膠原纖維功能［7-8］。同時，成纖維細(xì)胞能夠分泌促炎或抗炎因子。這些綜合因素促使成纖維細(xì)胞成為受損神經(jīng)微環(huán)境重構(gòu)的重要參與者，其在神經(jīng)損傷和修復(fù)的進(jìn)程中起到重要作用［9-10］。因此，本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗，研究夏天無對成纖維細(xì)胞活性的調(diào)控作用，以進(jìn)一步探討夏天無改善坐骨神經(jīng)痛的機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗動物及細(xì)胞株

清潔級的SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK（閩）2012-0001，所有操作以盡可能減少對動物的損害為標(biāo)準(zhǔn)。NIH-3T3 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株，購自武漢普諾賽生命科技有限公司，批號為CL-0171，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

1.2 主要試劑

夏天無注射液（江西天施康中藥股份有限公司，批號Z36020694）；脂多糖（Solarbio，批號L8880-10mg）；胰酶（上海李記生物科技有限公司，批號AC15L811）；兔抗α-SMA 單克隆抗體（美國CST，批號19245T）；兔抗collagen l 單克隆抗體（英國Abcam，批號ab138492）；兔抗vimentin 單克隆抗體（英國Abcam，批號ab92547）；兔抗β-Actin多克隆抗體（英國Abcam，批號ab8227）；鼠抗TNF-α 單克隆抗體（美國Santa cruz，批號sc-52746）；鼠抗IL-10 單克隆抗體（美國Santa cruz，批號sc-365858）；Alexa 488 熒光標(biāo)記二抗（英國Abcam，批號ab150117）；Alexa 568 熒光標(biāo)記二抗（英國Abcam，批號ab175701）；防熒光淬滅劑（美國Vector labs，批號H-1200-10）。

1.3 主要儀器

Leica CM 1950 恒溫箱冰凍切片機(jī)（德國Leica公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；紫外凝膠成像儀（美國Bio-rad 公司）；酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo 公司）；Von Frey 測痛纖絲（美國 North coast 公司）；熱刺痛儀（中國正華公司）。

2 方法

2.1 動物實(shí)驗

2.1.1 造模、分組以及給藥 實(shí)驗動物經(jīng)腹腔注射烏拉坦5 mL/kg 進(jìn)行麻醉，暴露左側(cè)后肢皮膚，在左側(cè)后肢股骨近中段做斜向切口，鈍性分離肌肉后暴露坐骨神經(jīng)，建立坐骨神經(jīng)痛模型［5］。術(shù)后大鼠分籠單獨(dú)飼養(yǎng)。造模成功后，大鼠隨機(jī)分為模型7 d 組、模型28 d 組、夏天無7 d 組和夏天無28 d 組，每組8 只；另取8 只大鼠作為假手術(shù)組，僅暴露坐骨神經(jīng)，不做其它處理。夏天無7 d 組和夏天無28 d 組術(shù)后腹腔注射夏天無注射液，分別于術(shù)后7 d 和28 d 取材。模型7 d 組、模型28 d組和假手術(shù)組，術(shù)后均以0.9%生理鹽水進(jìn)行注射。假手術(shù)組、模型7 d 組于術(shù)后7 d 時取材，模型28 d組于術(shù)后28 d 時取材。給藥劑量、次數(shù)為每組每只動物注射0.2 mL，1 次/2 d。

2.1.2 Von Frey 針刺實(shí)驗 采用 Von Frey 纖維絲測定大鼠雙側(cè)后爪縮爪閾值變化。將大鼠放置于底部為細(xì)鋼絲網(wǎng)格的籠中30 min，待其適應(yīng)環(huán)境后，采用不同規(guī)格的 Von Frey 絲垂直刺激大鼠的后足掌部，使 Von Frey 絲彎曲，并保持6～8 s，觀察并記錄大鼠的反應(yīng)。

2.1.3 熱敏實(shí)驗 采用局部熱刺痛測定大鼠足底的熱敏痛閾值變化。采用大鼠熱刺痛儀，溫度設(shè)定為55 ℃，將熱刺痛源放置于大鼠的后肢腳掌部，當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮足或舔足反應(yīng)時開始記錄。每只大鼠每只腳掌照射3 次，取3 次測定值的平均數(shù)為測定結(jié)果，為防止大鼠燙傷，上限時間設(shè)置為40 s。

2.1.4 切片制備 每組動物在各時間結(jié)束點(diǎn)時，均以腹腔注射烏拉坦5 mL/kg 劑量進(jìn)行麻醉，用4%多聚甲醛灌注固定24 h 后，截取大鼠的左側(cè)坐骨神經(jīng)損傷段（長度約為1 cm）。神經(jīng)組織經(jīng)蔗糖溶液梯度脫水后，利用冰凍切片機(jī)進(jìn)行冰凍切片，坐骨神經(jīng)行縱切，厚度為12 μm。

2.1.5 免疫熒光染色 為了觀察坐骨神經(jīng)損傷區(qū)域微環(huán)境的成纖維細(xì)胞應(yīng)答情況，取坐骨神經(jīng)切片進(jìn)行免疫熒光染色。切片經(jīng)PBST 清洗，1% Triton破膜1 h，5%牛血清蛋白（BSA）封閉 30 min，然后分別用 1% BSA 稀釋的抗vimentin、α-SMA、collagen 1 的一抗4℃孵育過夜，繼而加入相應(yīng)熒光二抗室溫孵育2 h，使用含DAPI 的防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照分析。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 細(xì)胞使用含有10%小牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，分為對照組、LPS 組、夏天無+LPS 組、夏天無組。LPS 組及夏天無+LPS 組分別加以1 μg/mL 的LPS 誘導(dǎo)24 h建立損傷模型。夏天無注射液安瓿瓶在超凈臺內(nèi)經(jīng)紫外照射后，用注射針吸出放置于5 mL 離心管中備用，實(shí)驗時用無菌的完全培養(yǎng)基進(jìn)行相應(yīng)稀釋后用于后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗。

2.2.2 CCK-8 法測細(xì)胞活力 將各組細(xì)胞接種入96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為5×103個。待細(xì)胞貼壁后，LPS 組和夏天無+LPS 組分別加入LPS（1 μg/mL），在37 ℃下孵育24 h。隨后將夏天無（0.5 μL/mL）分別加入到夏天無+LPS 組、夏天無組中，孵育4 h。再向每個孔中添加10 μL 的CCK-8 溶液，并在37 ℃下避光孵育1 h。使用酶標(biāo)儀檢測其在450 nm 處的OD值，并進(jìn)行相關(guān)計算。

2.2.3 免疫熒光染色 24 孔板的每孔底部鋪設(shè)細(xì)胞爬片，隨后將細(xì)胞接種于板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為2×104個，待細(xì)胞貼壁后用LPS（1 μg/mL）分別刺激LPS 組和夏天無+LPS 組24 h，隨后分別加入夏天無（0.5 μL/mL）干預(yù)夏天無+LPS 組和夏天無組4 h，用PBS 潤洗，4%多聚甲醛固定30 min，1%Triton X-100 中破膜30 min，5% BSA 封閉1 h。然后用相關(guān)一抗在4℃下孵育過夜，繼而用相應(yīng)熒光二抗室溫孵育2 h。最后用含DAPI 的防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察及拍照。

2.2.4 Western Blot 采用免疫印跡法檢測細(xì)胞中vimentin、α-SMA 的蛋白表達(dá)情況。收集干預(yù)完成后的每組細(xì)胞，分別加入配有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液冰上裂解30 min，高速離心20 min后，提取細(xì)胞裂解物，定量后加入蛋白上樣緩沖液。SDS-PAGE 電泳后，PVDF 轉(zhuǎn)膜，再用5% BSA 封閉1 h，加以相關(guān)的一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，最后用化學(xué)發(fā)光法顯色。

2.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 采用ELISA 法檢測成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液的炎癥因子TNF-α 和IL-10，以及膠原蛋白collagen 1 的分泌情況。成纖維細(xì)胞經(jīng)LPS 和夏天無干預(yù)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒說明書操作，分別檢測各成分的分泌情況。在反應(yīng)結(jié)束時，用酶標(biāo)儀檢測其在450 nm波長的吸光度OD 值。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Image-Pro Plus 6.0 進(jìn)行熒光平均光密度值分析和免疫印跡條帶分析，SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 夏天無減輕坐骨神經(jīng)痛模型大鼠機(jī)械痛和熱痛敏感程度，改善坐骨神經(jīng)痛

神經(jīng)損傷導(dǎo)致動物疼痛閾值降低，模型組疼痛閾值降低較明顯。夏天無上調(diào)疼痛閾值，減輕機(jī)械痛和熱痛敏感程度，在一定程度上改善坐骨神經(jīng)痛。2 組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 夏天無對坐骨神經(jīng)痛模型大鼠疼痛閾值的影響

3.2 夏天無減少神經(jīng)受損區(qū)域的成纖維細(xì)胞標(biāo)志物vimentin 蛋白表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)在受損神經(jīng)纖維內(nèi)部或神經(jīng)外膜區(qū)域，假手術(shù)組的成纖維細(xì)胞分布較少。模型組的成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增加，成纖維細(xì)胞標(biāo)志物vimentin 波形蛋白表達(dá)增強(qiáng)。與同時間點(diǎn)的模型組比較，夏天無組的成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)與同時間點(diǎn)的模型組比較，夏天無組的vimentin 蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。以上結(jié)果說明夏天無減少成纖維細(xì)胞在受損神經(jīng)損傷區(qū)域的浸潤。見圖2。

圖2 夏天無對坐骨神經(jīng)受損區(qū)域的成纖維細(xì)胞標(biāo)志物vimentin蛋白表達(dá)的影響

3.3 夏天無減少神經(jīng)受損區(qū)域的成纖維細(xì)胞collagen 1 和α-SMA 蛋白表達(dá)

周圍神經(jīng)損傷后，成纖維細(xì)胞激活，分泌膠原蛋白collagen 1 等成分，參與組織損傷修復(fù)過程。研究發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組的collagen 1 蛋白表達(dá)較少，模型組在損傷區(qū)的collagen 1 蛋白表達(dá)增加。與同時間點(diǎn)的模型組比較，夏天無組的collagen 1 蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05），見圖3A、3B。肌成纖維細(xì)胞通常被認(rèn)為是成纖維細(xì)胞激活狀態(tài)，它能夠產(chǎn)生更多的纖維成分，引起膠原瘢痕等從而阻礙微環(huán)境改善［11］。實(shí)驗檢測發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA 蛋白表達(dá)較少，模型組在損傷區(qū)的α-SMA 蛋白表達(dá)增加。與同時間點(diǎn)的模型組比較，夏天無組α-SMA 蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05），見圖3C、3D。以上結(jié)果說明夏天無減少成纖維細(xì)胞在損傷區(qū)的激活，減少膠原纖維在受損區(qū)域的蓄積，可能有利于受損神經(jīng)微環(huán)境的恢復(fù)。

圖3 夏天無對坐骨神經(jīng)受損區(qū)域的collagen 1或α-SMA蛋白表達(dá)的影響

3.4 夏天無上調(diào)LPS 誘導(dǎo)損傷后的NIH-3T3 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的活力

體外實(shí)驗中培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞活力分析用CCK-8 檢測。分別觀察不同夏天無濃度在有無LPS刺激下對NIH-3T3 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的作用（0.25，0.5，1 μL/mL），并分析細(xì)胞孵育后的相對活力（以24 h 未處理的細(xì)胞活力設(shè)為100%）。結(jié)果顯示在沒有LPS 刺激時，不同濃度的夏天無處理后的成纖維細(xì)胞活力變化不明顯，說明夏天無對NIH-3T3 成纖維細(xì)胞無細(xì)胞毒性作用。當(dāng)LPS 刺激后，成纖維細(xì)胞活力明顯降低。添加夏天無干預(yù)后，細(xì)胞活力增強(qiáng)，特別是0.5 μL/mL 濃度組表現(xiàn)相對明顯（P＜0.05）。因此，在實(shí)驗期間以0.5 μL/mL 夏天無濃度作為檢測所需濃度。見圖4。

圖4 CCK-8法顯示夏天無對LPS誘導(dǎo)后成纖維細(xì)胞活力的影響

3.5 夏天無抑制LPS 誘導(dǎo)損傷后的成纖維細(xì)胞激活和膠原蛋白分泌

通過檢測成纖維細(xì)胞標(biāo)記物（vimentin）和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物（α-SMA）的表達(dá)，以及collagen 1 蛋白分泌情況，分析夏天無干預(yù)對LPS誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活性的影響。免疫熒光染色顯示在LPS 組的vimentin 和α-SMA 蛋白表達(dá)增加明顯，但在夏天無+LPS 組中有所減少（P＜0.05），見圖5A-D。Western Blot 檢測結(jié)果與免疫熒光趨勢相符，與LPS 組相比，夏天無+LPS 組的vimentin和α-SMA 蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），見圖5E。ELISA 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然膠原蛋白collagen 1 在LPS 組和夏天無+LPS 組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但其表現(xiàn)出下降趨勢，見圖5F。以上結(jié)果說明夏天無可能減少LPS 誘導(dǎo)損傷后的成纖維細(xì)胞的激活和膠原蛋白分泌。

圖5 夏天無對LPS誘導(dǎo)損傷后的成纖維細(xì)胞激活狀態(tài)的影響

3.6 夏天無減少成纖維細(xì)胞促炎因子表達(dá)，增強(qiáng)抗炎因子表達(dá)

實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)LPS 刺激成纖維細(xì)胞損傷后，促炎因子TNF-α 的蛋白表達(dá)增加。但在夏天無+LPS 組TNF-α 的蛋白表達(dá)有所減少（P＜0.05），見圖6A、6B。同時，LPS 刺激細(xì)胞損傷后，抗炎因子IL-10 的蛋白表達(dá)減少。但在夏天無+LPS 組IL-10 的表達(dá)有所增加（P＜0.05），見圖6C、6D。ELISA 結(jié)果顯示相對于LPS 組，夏天無+LPS 組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的促炎因子TNF-α 分泌量下調(diào)，抗炎因子IL-10 分泌量上調(diào)（P＜0.05），見圖6E、6F。以上結(jié)果說明夏天無減少LPS 誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的促炎因子分泌、增加抗炎因子的分泌量，參與炎癥應(yīng)答。

圖6 夏天無對LPS誘導(dǎo)損傷后的成纖維細(xì)胞炎癥因子分泌的影響

4 討論

坐骨神經(jīng)痛在中醫(yī)學(xué)上屬“痹證”“腰腿痛”范疇，通常由于經(jīng)絡(luò)不通、氣血瘀滯所引起，臨床上通常采用消炎鎮(zhèn)痛、活血化瘀治療坐骨神經(jīng)痛［12-13］。中藥夏天無具有活血通絡(luò)、行氣止痛的功效，前期研究已證實(shí)夏天無干預(yù)改善坐骨神經(jīng)痛大鼠的受損區(qū)域微環(huán)境，減輕坐骨神經(jīng)痛，減少受損神經(jīng)腫脹程度，減少受損區(qū)域的巨噬細(xì)胞浸潤［5-6］，但夏天無對成纖維細(xì)胞的影響仍未明確。

成纖維細(xì)胞是一類間充質(zhì)細(xì)胞，參與組織穩(wěn)態(tài)和疾病，其被異常激活時，會導(dǎo)致纖維化疾病［14-15］。有文獻(xiàn)表明神經(jīng)損傷和修復(fù)部位的疤痕是阻滯神經(jīng)愈合進(jìn)程的主要因素，過度纖維化可影響神經(jīng)功能，引起神經(jīng)栓塞或壓迫，改變神經(jīng)周圍微血管，阻礙軸突遷移，損害神經(jīng)再生。控制神經(jīng)周圍纖維化對神經(jīng)修復(fù)有重要意義［16-17］。在本實(shí)驗中，研究發(fā)現(xiàn)夏天無能夠減弱坐骨神經(jīng)痛模型大鼠成纖維細(xì)胞標(biāo)志物vimentin 蛋白表達(dá)，減少成纖維細(xì)胞的激活狀態(tài)下的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA 蛋白表達(dá)，減少受損區(qū)域collagen 1 蛋白的表達(dá)，初步說明夏天無干預(yù)后抑制神經(jīng)受損區(qū)域的成纖維細(xì)胞浸潤、激活，減少膠原纖維蓄積。但是體內(nèi)環(huán)境相對復(fù)雜，周圍神經(jīng)微環(huán)境不僅存在著成纖維細(xì)胞，還有其他細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、施萬細(xì)胞等。因此本實(shí)驗檢測夏天無調(diào)控成纖維細(xì)胞的作用，進(jìn)一步開展細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗，通過LPS 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)夏天無干預(yù)后成纖維細(xì)胞的vimentin、α-SMA表達(dá)降低，膠原蛋白分泌減少，表明夏天無能抑制成纖維細(xì)胞活性。

炎癥反應(yīng)通常能夠加重神經(jīng)損傷和疼痛［18］。前期研究發(fā)現(xiàn)夏天無能夠抑制巨噬細(xì)胞的炎性應(yīng)答，但并未考慮成纖維細(xì)胞的炎性應(yīng)答情況。由于成纖維細(xì)胞也是神經(jīng)微環(huán)境的炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的關(guān)鍵細(xì)胞來源，其參與炎癥的發(fā)生發(fā)展［19-20］。因此在本實(shí)驗中檢測了成纖維細(xì)胞的炎性因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)夏天無減少LPS 誘導(dǎo)損傷后的成纖維細(xì)胞促炎因子TNF-α 表達(dá)，增加抗炎因子IL-10 表達(dá)，初步表明夏天無減輕成纖維細(xì)胞所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

結(jié)合前期研究，推測夏天無具備消腫、消炎、化瘀等功效，能夠減少成纖維細(xì)胞的激活和膠原蛋白的分泌、抑制纖維化和減少促炎因子的釋放，從而使坐骨神經(jīng)微環(huán)境得到一定改善，避免傷害性信息的過度輸出，從而起到改善坐骨神經(jīng)痛的作用。