假單胞菌對新疆大南湖低階煤降解研究與分析

木欣凱 ，劉向榮，2 ，石 晨 ，吳 昊

(1. 西安科技大學化學與化工學院，陜西省西安市，710054；2. 自然資源部煤炭資源勘查與綜合利用重點實驗室，陜西省西安市，710021)

0 引言

新疆煤炭占全國煤炭預測儲量的39.3%，其中低階煤又占新疆煤炭資源總量的80%[1-3]，新疆大南湖礦區的低階煤主要以長焰煤為主[4-5]。低階煤具有煤化程度低、灰分含量高、揮發分高、熱值低等特點，煤炭傳統的轉化方式主要有煤氣化、液化和煤熱解等方式，均需在高溫、高壓下進行，不但設備復雜、條件苛刻，還會造成大氣污染[6]。近幾年興起的微生物降解煤炭技術，由于在常溫常壓下進行，且設備簡單、條件溫和，被認為是煤炭清潔轉化的新途徑之一。

煤的微生物降解研究起源于20世紀80年代，Cohen 和 Gabriele[7-8]發現一些真菌可以將低階煤降解為黑色液體，此后大量研究者開始微生物降解煤的研究，吳昊等[9]利用日本假單胞菌降解新疆烏冬煤，發現日本假單胞菌細胞分泌的活性物質對新疆烏冬煤有較好的降解效果；石晨等[10]研究日本假單胞菌對內蒙古煤炭的降解機理，發現日本假單胞菌的生物降解性與其分泌的酯酶和鼠李糖脂有關；Muthukumar B等[11]研究銅綠假單胞菌降解原油的特性，認為銅綠假單胞菌可以有效的降解烷烴、芳烴類物質，且細菌產生的胞外酶和生物表面活性劑在原油生物降解過程中起著關鍵作用；張翠坤等[12]通過研究銅綠假單胞菌降解原油的過程，發現銅綠假單胞菌能夠利用多種碳源合成鼠李糖脂，對長鏈烷烴有極好的降解效果；楊智等[13]對1株從石油污染土壤中分離得到的銅綠假單胞菌進行特異性PCR擴增，在菌株中檢測到烷烴單加氧酶、甲苯雙加氧酶、聯苯雙加氧酶、芳香烴雙加氧酶和氧化還原酶等與石油降解相關的基因，發現銅綠假單胞菌具有廣泛的碳氫化合物降解范圍；何春秋等[14]通過基因工程重組構建銅綠假單胞菌，增加鼠李糖脂的產量，提高了銅綠假單胞菌對原油的生物降解性，進一步證明銅綠假單胞菌分泌的鼠李糖脂對碳氫化合物有較好的降解效果；李建濤等[15]利用惡臭假單胞菌降解山西臨汾褐煤，發現惡臭假單胞菌對山西臨汾褐煤有較好的降解效果，并通過正交實驗得到4種降解條件的影響權重為：煤樣粒度>煤漿濃度>培養時間>接種量；韓嬌嬌等[16]從采集的煤、腐木和土壤樣品中可分離、鑒定出能夠高效降解新疆低階煤的菌株，篩選結果表明，假單胞菌屬和芽孢桿菌屬對新疆低階煤有較高的降解能力。

綜合上述研究結果可以看出，假單胞菌屬對煤炭、石油等碳氫大分子化合物的降解效果較為顯著，因此研究假單胞菌屬對新疆大南湖煤的降解過程及降解產物，可為新疆大南湖地區煤炭生物轉化技術的應用提供理論依據。

筆者及其研究團隊以新疆大南湖低階煤為研究對象，利用能夠降解芳香結構的日本假單胞菌和降解脂肪烴效果尚佳的銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤，探究菌液量、煤漿濃度、降解時間對細菌降解新疆大南湖低階煤的影響，通過正交實驗確定最優工藝條件，最后利用紅外光譜儀、X射線衍射儀對固相降解產物進行分析，利用氣相色譜-質譜聯用儀對液相降解產物進行分析，研究降解過程和分析產物的組成，以期篩選出對新疆大南湖低階煤降解效果優異的優勢菌種。

1 實驗研究

1.1 材料與儀器

主要試劑為生物試劑，包括蛋白胨、牛肉膏和瓊脂粉，其他試劑為氯化鈉(分析純)、濃硝酸(分析純)；主要儀器有CTDG-200875密封對輥破碎機、XMB棒磨機、PS-200振篩機、SW-CJ-1FD超凈工作臺、BL-50A立式壓力蒸汽滅器、BC-360生化培養箱、HZQ-F100全溫振蕩培養箱、Spectrum GX傅里葉變換紅外光譜儀、Mini Flex 600 X射線衍射儀和Agilent7890A氣相色譜-質譜聯用儀。

1.2 煤樣的預處理

煤樣選用新疆大南湖地區低階煤，經過破碎、研磨和篩分，獲得粒徑為0.25～0.50 mm的煤樣，用8 mol/L的硝酸按照煤∶硝酸為1.0∶2.5 g/mL的比例對煤樣進行浸泡氧化，使煤樣與硝酸充分接觸，氧化48 h后用去離子水沖洗，觀察濾液顏色；待濾液澄清，檢測濾液pH，當濾液pH大于5.6時，氧化預處理過程結束；收集煤樣用于后續降解實驗，煤樣氧化后，芳香環羧基化，側鏈烷基氧化和硝化，氧化作用使煤易被細菌降解[17-18]。

1.3 微生物的培養

日本假單胞菌、銅綠假單胞菌均購于中國微生物菌種保藏管理中心(CICC)，編號分別為CICC 23895和CICC 10204。

1.3.1 培養基

2種細菌的培養基相同，采用中國微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供的營養肉汁培養基(CM0002)，具體配方為蛋白胨取5 g、牛肉膏取3 g、瓊脂(固體)取15 g、氯化鈉5 g、蒸餾水取1 L，培養基pH為7。

1.3.2 菌種培養

將已活化與純化培養后的菌種接種到裝有250 mL已滅菌液體培養基的錐形瓶中，置于30 ℃、160 r/min的全溫振蕩培養箱中進行培養，擴大培養后的菌液用于后續的降解實驗。

1.4 微生物降解實驗

1.4.1 單因素實驗

將0.3 g煤樣和50 mL液體培養基置于150 mL的錐形瓶中放入高壓滅菌鍋滅菌15 min，待培養基冷卻到室溫時，加入10 mL菌液，然后將錐形瓶放入溫度為30 ℃、轉速為160 r/min的恒溫振蕩培養箱中進行培養，實驗結束后離心(1萬r/min，20 min)分離得到未降解的固相產物(殘煤)和液相產物。用蒸餾水對殘煤進行洗滌，直至殘煤中無菌體殘留后烘干、備用[19-20]。在相同培養條件下，分別改變菌液量、煤漿濃度和降解時間，研究各因素對微生物降解新疆大南湖低階煤的影響。單因素實驗設計見表1。

表1 單因素實驗設計

1.4.2 正交試驗

在單因素實驗的基礎上，設計三因素三水平的正交實驗表，根據單因素實驗結果選擇單因素實驗中降解效果良好的區間作為正交實驗的3個不同水平，即菌液量最優區間為20～40 mL、煤漿濃度的最優區間為6～14 g/L、降解時間的最優區間為12～16 d，利用正交實驗得出最優工藝條件。正交實驗的因素與水平見表2。

表2 正交實驗因素及水平

1.5 降解效果評價指標

目前評價煤炭降解效果的方法主要有差減法和吸光度A450。

1.5.1 利用差減法計算降解率

微生物降解煤炭的效果可以用降解率η來評價，η的計算見式(1)[21]：

(1)

式中：η——降解率，%；

W0——加入煤樣的質量，g；

W1——煤樣降解后殘煤的質量，g。

1.5.2 利用吸光度A450評價降解效果

在微生物降解煤炭的過程中，隨著降解過程的進行，降解液的顏色逐漸加深，吸光度也逐漸增加，并且在450 nm處有明顯的吸收峰，所以降解產物的黑色降解液在450 nm處對可見光的吸光度可間接反映降解率的高低[22-23]。

筆者選擇吸光度A450作為煤炭降解效果評價指標，是由于選擇吸光度A450易于測量、結果精確、判斷煤樣降解率更為準確。

1.6 降解產物的表征

1.6.1 固相產物的表征方法

準確稱取1 mg干燥后的殘煤與200 mg的溴化鉀(KBr)混合，制成薄片，用Spectrum GX傅里葉變換紅外光譜儀進行掃描，設置波長為4 000～400 cm-1，掃描分辨率為4 cm-1。采用Mini Flex600 X射線衍射儀，對殘煤進行XRD分析，設置掃描速度為2°/min，掃描范圍為5°～70°。

1.6.2 液相產物的表征方法

將最佳工藝條件下得到的黑色降解產物，依次使用甲苯、乙酸乙酯、二氯甲烷萃取，液相產物與有機溶劑的萃取體積比為1∶2，萃取液利用Agilent7890A氣相色譜-質譜聯用儀進行分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 煤漿濃度對煤樣降解效果的影響

煤漿濃度對2種假單胞菌降解煤樣的影響如圖1所示。

圖1 煤漿濃度對2種假單胞菌降解煤樣的影響

由圖1可以看出，隨著煤漿濃度逐漸增大，2種降解產物的A450呈現出逐漸增大的趨勢，2種假單胞菌的最佳煤漿濃度均為6 g/L，2種假單胞菌的A450值均為0.675。這是因為較低的煤漿濃度提供的碳源有限，細菌的降解效率受到限制；而當煤漿濃度過大時，高濃度的碳源使細菌保持過高的活性，細菌之間互相競爭培養基中營養物質，使細菌與培養基中營養物質進行物質交換的過程受到影響，培養基中營養物質不足以支撐細菌生長，細菌生長受到抑制，微生物對煤炭的降解效果大幅度下降。日本假單胞菌對煤漿濃度的環境更加敏感，高濃度的煤漿環境對日本假單胞菌的生長影響巨大；銅綠假單胞菌對煤漿環境的適應能力更強，在高濃度煤漿環境下，仍舊有較好的降解效果。

2.1.2 菌液量對煤樣降解效果的影響

菌液量對2種假單胞菌降解煤樣的影響如圖2所示。

圖2 菌液量對2種假單胞菌降解煤樣的影響

由圖2可以看出，日本假單胞菌降解產物的A450隨著菌液量的增加而呈現出逐漸增加的趨勢，當菌液量為40 mL時，A450值達到最大，為0.773，降解效果最好。這是因為隨著菌液量的增加，細菌數量和活性明顯增加，對煤樣的降解效果也越來越好；而隨著菌液量的進一步增加，細菌對煤樣的降解效果并沒有顯著增加甚至開始減弱。這是因為培養基中的營養物質有限，高濃度的菌液會加劇細菌之間的惡性競爭，導致培養基中營養物質快速減少，進而抑制細菌的生長[24]。但當菌液量超過一定數值后，加入的細菌菌液本身就保持極高的活性，也具有較好的降解活性，因此日本假單胞菌在菌液量為40 mL時對煤炭的降解效果最好。同樣，銅綠假單胞菌降解產物的A450也隨菌液量的增加而呈現出先增加后減小的趨勢，但并未出現減小之后再增加的情況，這說明此時的銅綠假單胞菌已經達到生長極限，后續增加菌液量會導致細菌衰亡。因此，銅綠假單胞菌在菌液量為30 mL時，A450達到最大，為0.907，降解效果最好。

2.1.3 降解時間對煤樣降解效果的影響

降解時間對2種假單胞菌降解煤樣的影響如圖3所示。

圖3 降解時間對2種假單胞菌降解煤樣的影響

由圖3可以看出，隨著降解時間的增加，2種假單胞菌降解產物的A450值也越來越高，最終趨于平穩。這是由于剛開始細菌生長活性高，對氧化煤的降解效果提升比較明顯，而隨著時間的增加，細菌逐漸開始凋亡，活菌數量減少，因此最終A450值在14 d時趨于平穩，此時日本假單胞菌和銅綠假單胞菌的A450值分別為0.779和0.660，后續再增加降解時間，降解率幾乎不再變化。同時，相同時間內，日本假單胞菌降解氧化煤的降解率均高于銅綠假單胞菌，這是因為2種細菌對環境適應能力不同，導致了繁殖能力產生差異。

2.2 正交實驗結果

2.2.1 日本假單胞菌降解煤樣的正交實驗結果

日本假單胞菌降解煤樣的正交實驗結果見表3。

表3 日本假單胞菌降解煤樣的正交實驗結果

日本假單胞菌降解煤樣的極差分析見表4。

表4 日本假單胞菌降解煤樣的極差分析

在選定的實驗條件區間中，各因素對日本假單胞菌降解煤樣影響的主次順序依次為：煤漿濃度>菌液量>降解時間。煤漿濃度在細菌降解煤樣過程中產生了顯著性影響，這是因為煤漿環境對日本假單胞菌生長有一定的影響造成的。研究結果表明，日本假單胞菌降解煤樣的最優降解工藝參數組合為A1B3C3，即菌液量20 mL、煤漿濃度14 g/L、降解時間16 d，在此工藝條件下，日本假單胞菌對煤樣的降解率最大為45.27%。

日本假單胞菌降解煤樣的正交實驗數據方差分析見表5。

表5 日本假單胞菌降解煤樣的正交實驗數據方差分析

方差分析用于分析實驗數據的波動情況，表中數據均使用正交實驗分析軟件計算得出，其中AdjSS為正交實驗數據的離差平方和，AdjMS為均方，F值為統計量，P值為顯著性，可以反應一組數據的偶然性，P值越低，數據偶然性越小，R2為判定系數，R2(adj)為調整后的判定系數，通過正交實驗分析軟件計算得出R2=99.80%、R2(adj)=99.19%，共同說明不同單因素數據之間的關系強度，反應數據的可信度，從方差分析表中也可以看出，煤漿濃度在細菌降解新疆大南湖低階煤的過程中產生了顯著性影響。

2.2.2 銅綠假單胞菌降解煤樣的正交實驗結果

銅綠假單胞菌降解煤樣的正交實驗結果見表6。

表6 銅綠假單胞菌降解煤樣的正交實驗結果

日本假單胞菌降解煤樣的極差分析見表7。

表7 日本假單胞菌降解煤樣的極差分析

正交實驗極差R的計算結果表明，在選定的實驗條件區間中，各因素對銅綠假單胞菌降解煤樣的影響的主次順序依次為：煤漿濃度>菌液量>降解時間。煤漿濃度在銅綠假單胞菌降解煤樣過程中產生了顯著性影響，這是因為煤漿環境對銅綠假單胞菌生長有一定影響造成的。最終得出銅綠假單胞菌降解煤樣的最優降解工藝參數組合為A2B2C3，即菌液量30 mL、煤漿濃度10 g/L、降解時間16 d。在此工藝條件下，銅綠假單胞菌對新疆大南湖低階煤的降解率最大為35.92%。

銅綠假單胞菌降解煤樣的正交實驗數據方差分析見表8。

表8 銅綠假單胞菌降解煤樣的正交實驗數據方差分析

表8中數據均使用正交實驗分析軟件計算，最終得出該組數據的判定系數為R2為99.06%、R2(adj)為96.26%。表8中數據與日本假單胞菌數據均不相同，但3個不同單因素下AdjSS、AdjMS和F的大小規律均為煤漿濃度>菌液量>降解時間，同樣說明煤漿濃度在細菌降解新疆大南湖低階煤的過程中產生了顯著影響。

2.3 煤樣的工業分析與元素分析

煤炭的工業分析和元素分析中的各項指標是判斷煤質的重要參考，采用《煤的工業分析方法》(GB/T 212-2008)規定的測試方法對煤樣進行了工業分析。煤樣工業分析及元素分析見表9。

表9 煤樣工業分析及元素分析

由表9可以看出，原煤揮發分為48.95%，碳含量偏低，屬于變質程度較低的低階煤。原煤經硝酸氧化處理后灰分明顯降低，說明硝酸預處理具有脫灰作用[25]。原煤經過硝酸氧化后，C、H元素含量顯著下降，N、O元素含量明顯上升，這是因為硝酸破壞了煤的分子結構，發生了氧化及硝化作用[26]；降解后的殘煤與氧化煤相比較，C、N元素含量下降，H、O元素含量上升，O元素含量的上升說明微生物的降解過程伴隨著氧化反應的發生[27]，銅綠假單胞菌對煤炭的氧化作用更明顯。

2.4 紅外光譜分析

新疆大南湖原煤、氧化煤及日本假單胞菌降解后殘煤和銅綠假單胞菌降解后殘煤的紅外光譜如圖4所示。

a-氧化煤；b-原煤；c-日本假單胞菌降解后殘煤；d-銅綠假單胞菌降解后殘煤。圖4 煤樣的紅外光譜

由圖4可以看出，原煤、氧化煤和殘煤的峰型基本一致，都在3 410～3 425 cm-1范圍處有強而寬的吸收峰，此處吸收峰主要是因為酚和羧酸上的羥基發生伸縮振動導致的，氧化煤和降解后的殘煤都在1 000～1 300 cm-1的范圍內有較多的吸收峰，這是因為C-O鍵的伸縮振動導致的，主要是芳香酯和醚的C-O-C以及芳香族的C-OH，而氧化煤較原煤吸收峰更多，說明氧化反應可以改變煤的結構，氧化煤在1 706 cm-1和1 421 cm-1處出現的吸收峰是因為芳烴中的C=O鍵和硝基中的N=O鍵的伸縮振動，這與康紅麗[28]的實驗結果一致，而原煤中并沒有出現這2個峰，說明硝酸氧化使煤的結構發生變化，出現了C=O和N=O這類基團，而氧化煤經過細菌降解后，2處透過率減弱證明細菌可以降解C=O和N=O結構，日本假單胞菌降解后殘煤與銅綠假單胞菌降解后殘煤相比，2 921 cm-1和2 856 cm-1處出現明顯的吸收峰，這是由于-CH2不對稱伸縮振動和-CH3對稱伸縮振動導致的；在1 710 cm-1處多出1個吸收峰，此處吸收峰主要是因為-COOH發生伸縮振動導致的，說明日本假單胞菌降解后的氧化煤中存在更多的-COOH官能團；銅綠假單胞菌降解后殘煤在2 921 cm-1和2 856 cm-1處吸收峰明顯減弱，867 cm-1處多出1個吸收峰，此處是苯環五取代吸收峰，表明銅綠假單胞菌降解后的氧化煤中存在苯環五取代結構[29]。

2.5 XRD分析

利用Mini Flex600 X射線衍射儀對原煤、氧化煤及各殘煤進行分析，分析結果如圖5所示。

圖5 煤樣的XRD分峰擬合

由圖5可以看出，衍射角2θ在23°～25°和35°～40°區間內各煤樣存在002峰和100峰，002峰和100峰分別代表芳香層片堆砌的高度和芳香環縮合的程度。002峰具有對稱性，而圖5中002峰并未出現明顯的對稱性，這是由于002峰和γ這2種微晶峰相互疊加導致的。因此對其進行基線校正和平滑處理，然后對平滑后的曲線進行峰值擬合，使用布拉格公式和謝樂公式計算各晶格參數[30]，各煤樣XRD擬合結構參數見表10，氧化煤和原煤相比芳香層片的間距d002減小，說明煤樣氧化后的芳構化程度變高，有序程度升高。氧化煤經2種假單胞菌降解后，芳香層片堆砌高度Lc減小，芳香層數N減小，這說明煤中含氧官能團、芳香環等結構被降解[31-32]；而對比日本假單胞菌降解后殘煤和銅綠假單胞菌降解后殘煤的各結構參數，日本假單胞菌降解后殘煤的002峰和100峰未出現明顯偏離，芳香層片的間距d002和d100變化并不顯著；但日本假單胞菌降解后殘煤的芳香層片間距d002增大，層片堆砌高度Lc減少，芳香層片寬度La減小，芳香層數N減少，表明日本假單胞菌降解后殘煤芳香層之間的作用力減少，芳香層更加松散[33]；此現象說明日本假單胞菌對煤中部分側鏈和官能團的降解效果優于銅綠假單胞菌，改變了煤中密集的芳香結構[34]。

表10 各煤樣XRD擬合結構參數

2.6 氣相色譜-質譜聯用分析

采用氣相色譜-質譜聯用儀對2種假單胞菌降解新疆大南湖低階煤后的液相產物進行分析，2種假單胞菌降解煤樣液相產物總離子流色譜如圖6和圖7所示。

圖6 日本假單胞菌降解煤樣液相產物總離子流色譜

圖7 銅綠假單胞菌降解煤樣液相產物總離子流色譜

通過總離子流色譜可觀察到不同保留時間下檢測出的物質，相對豐度反應檢測出物質的峰強度，將檢測出的物質用軟件計算可以得到相應物質的分子量，液相產物的分子量主要集中在142.17～546.39。

日本假單胞菌降解煤樣的液相產物主要包含烷烴類、酯類、醇類等化合物，分子量在142.17～546.39；銅綠假單胞菌降解煤樣后的液相產物主要包含芳香類、苯酚類、烷烴類以及羧酸類、酯類化合物等，分子量集中在180.11～436.50，證明2種假單胞菌都可將煤樣的大分子結構解聚為小分子物質[35]。

2種假單胞菌降解煤樣的液相產物中化合物的組成見表11。

表11 2種假單胞菌降解煤樣的液相產物中化合物的組成 %

由表11可以看出，日本假單胞菌和銅綠假單胞菌降解煤樣后的液相產物甲苯萃取物中，含有豐富的烷烴類化合物，含量分別為73%、56%；乙酸乙酯萃取物中，銅綠假單胞菌降解煤樣的液相產物含氧官能團化合物種類更加豐富，含有豐富的羧酸、醛、含羥基官能團的化合物。二氯甲烷萃取物中，日本假單胞菌和銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤后，液相產物中含有豐富的酯類化合物，含量分別為61%、54%。銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤后液相產物的3種萃取物中均含有7，9-二叔丁基-1-氧雜吡啶(4，5)癸-6，9-二烯-2，8-二酮的物質，這說明銅綠假單胞菌降解煤炭的方式更加復雜，可能存在多種機理同時進行降解。日本假單胞菌降解的液相產物中含有豐富的烷烴類和酯類化合物，表明日本假單胞菌對煤炭中側鏈有良好的降解效果，與銅綠假單胞菌相比對煤炭結構影響較大，這可能是日本假單胞菌降解率高于銅綠假單胞菌的原因[36]。

3 結論

(1)日本假單胞菌降解新疆大南湖低階煤的最佳工藝條件為：菌液量20 mL、煤漿濃度14 g/L、降解時間16 d，最大降解率為45.27%；銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤的最佳工藝條件為：菌液量30 mL、煤漿濃度10 g/L、降解時間16 d，最大降解率為35.92%。在降解過程中，日本假單胞菌和銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤降解條件的影響權重一致，均為煤漿濃度>菌液量>降解時間。

(2)新疆大南湖低階煤經過日本假單胞菌和銅綠假單胞菌降解后，C、H元素含量下降，N元素含量上升。根據原煤、氧化煤以及殘煤的紅外光譜，結果表明2種假單胞菌可以降解氧化煤中的C=O和N=O等結構；通過XRD峰值擬合分析可知，2種假單胞菌均對氧化煤中的含氧官能團、芳香族化合物有較好的降解效果，而日本假單胞菌對芳香環結構的作用更加顯著。

(3)日本假單胞菌和銅綠假單胞菌降解液相產物的分子量均集中在142.17～546.39，液相產物中主要包含芳香類、烷烴類、醇類等小分子化合物。日本假單胞菌和銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤后液相產物甲苯萃取物中，烷烴類化合物含量最多，分別為73%、56%；二氯甲烷萃取物中，酯類化合物含量最多，分別為61%、54%；而乙酸乙酯萃取物中，銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤后的液相產物中含氧官能團化合物種類更加豐富；日本假單胞菌對煤炭中芳香環結構有良好的降解效果，與銅綠假單胞菌相比對煤炭結構影響較大，這可能是日本假單胞菌降解率高于銅綠假單胞菌的原因。

綜合上述結論，日本假單胞菌對新疆大南湖低階煤的降解效果優于銅綠假單胞菌，日本假單胞菌可以有效降解煤中的芳香環結構，進而篩選出日本假單胞菌是降解新疆大南湖低階煤的優勢菌種。而繼續進行細菌與煤炭的匹配實驗研究，對尋找降解煤炭的優勢菌種和建立菌煤匹配數據庫具有重要意義。