丹參素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯中間體縮合反應工藝?

余麗麗,譚 雄,2,張怡心,2,胡婭琪,楊 寬,秦 蓓??

(1.西安醫學院藥學院藥物研究所西安市多靶協同抗高血壓創新藥物研制重點實驗室,陜西西安 710021;2.成都醫學院藥學院,四川成都 610500)

高血壓是一種復雜的的心血管綜合癥,是具有多因素、多通路、多靶點的生物網絡性疾病,其發病機制復雜、治療較為困難[1]。普利類抗高血壓藥物屬于血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)類抗高血壓藥物,是臨床采用的一線藥物[2]。臨床應用發現普利類藥物可引起干咳、腎衰竭、血管性水腫等副作用[3],降低或者避免副作用是普利類藥物開發的要點。丹參素具有腦保護、心肌保護、肝保護、腎臟保護、血管保護等活性,且能與血管緊張素轉化酶活性中心的鋅離子絡合,實現協同降壓[4]。冰片具有抗炎、抗心肌缺血、芳香開竅、促小分子的透膜吸收的作用,能夠提高藥物的生物利用度[5]。據此,在組合中藥分子化學的策略下,前期研究證實基于以上理論設計篩選出來的普利母核候選化合物(丹參素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯)具有良好的降壓功效,能夠實現臟器保護。

丹參素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成路線見圖1[6-7],其中涉及了5種中間體的合成。

圖1 丹參素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成路線

其中,Boc-L-脯氨酸冰片酯和Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯中間體的合成屬于縮合反應。為提高工業化生產的可行性,作者對中間體Boc-L-脯氨酸冰片酸、Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成工藝進行重點研究,為丹參素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的工業化生產奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

DCM、DMF、四氫呋喃(THF)、二甲基亞砜(DMSO)、三氯氧磷(POCl3)、三乙胺(TEA):分析純,天津市恒興化學試劑公司;Boc-L-脯氨酸(Boc-L-Pro)、Boc-L-丙氨酸(Boc-L-Ala)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、EDCI、DMAP、2-(7-氮雜苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(Py BOP)、N,N-二異丙基乙胺(DIPEA):分析純,純度≥99%,上海阿拉丁公司;冰片、丹參素:西北大學。

高效液相色譜儀:Agilent 1260,三重四級桿質譜:Agilent 6460,美國安捷倫公司;核磁共振波譜儀:AVANCE Ⅲ(400MHz),德國瑞士Bruker公司;旋轉蒸發儀:N-1210,真空干燥箱:VOS-210C,日本RIKAKIKAI EYELA;紫外分析儀:ZF-7N,上海嘉鵬科技;磁力加熱攪拌器:HJ-2A,常州國華電器;電子分析天平:FA224,上海舜宇恒平科學儀器。

1.2 丹參素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯合成過程中縮合反應方法

1.2.1 Boc-L-脯氨酸冰片酯的合成

常壓,在燒瓶內分別加入150 m L PCM、DMF、THF等溶劑,加入冰片充分溶解后,加入Boc-L-脯氨酸,溶解完全后加入縮合劑,反應一定時間,通過薄層色譜(TLC)檢測反應是否完全。通過紫外、碘熏、茚三酮顯色劑、香草醛顯色劑等多種方式進行TLC顯色檢測。待反應完全后,加入乙酸乙酯(10 m L),用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌,水相用乙酸乙酯萃取3次,合并有機相,用飽和碳酸氫鈉、蒸餾水、w(HCl)＝10%水溶液、飽和氯化鈉洗滌有機相,用無水硫酸鈉干燥后,濃縮、真空干燥后,稱量,計算產率。

1.2.2 Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成

稱取一定量的化合物5,分別加入PCM、DMF、THF等溶劑,攪拌使Boc-L-脯氨酸冰片酯充分溶解。再加入Boc-L-丙氨酸,溶解后加入縮合劑,反應一定時間,TLC 監控反應。加入少量乙酸乙酯后,用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。水相用乙酸乙酯萃取3~4次,合并有機相,用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌3 次,蒸餾水洗滌1 次,w(HCl)＝10%水溶液洗滌3 次,飽和氯化鈉水溶液洗滌2次。洗滌后用無水硫酸鈉干燥、濃縮、真空干燥后,稱量,計算產率。

2 結果與討論

2.1 Boc-L-脯氨酸冰片酯合成工藝優化

2.1.1 縮合劑種類和用量的考察

采用1.2.1的合成方法,固定Boc-L-脯氨酸、冰片以及選定的2種縮合劑的物質的量比為1∶1∶1∶1,如果是一種縮合劑,則物質的量之比為1∶1∶1,V(反應溶劑)∶m(Boc-L-脯氨酸)為1∶6 ml/g,固定反應時間為6 h,考察縮合劑種類對實驗的影響,實驗結果見表1。

表1 縮合劑種類對化合物5合成產率的影響

由表1可知,單獨使用縮合劑EDCI,產率較低,通過TLC發現體系復雜、雜質含量多,這是因為羧酸被EDCI活化后形成的中間體不穩定,易轉化為副產物脲,通常可以加入催化劑如DMAP、HOBT 等能形成相對穩定的活性中間體,進而實現羧酸與醇的縮合酯化[8]。實驗以EDCI 與DMAP為復合縮合劑,發現反應的處理和純化相對容易,反應產率高,體系的雜質較少。此外,實驗還考察了EDCI和HOBT組合、EDCI和TEA組合及DMAP,發現均不能得到反應的目標產物。實驗還通過POCl3將羧酸轉化成酰氯后與醇反應生成酯[9-10],同時加入有機堿作為縛酸劑促使反應正向進行。由表1可知,POCl3參與的反應雖然能夠進行,但是產率較低,最終確認EDCI、DMAP為最優縮合劑。

考察了縮合劑n(EDCI)∶n(DMAP)的對反應產率的影響,結果見圖2。

圖2 縮合劑比例對化合物5產率的影響

由圖2可知,隨著EDCI投入量逐漸加大,反應產率表現出先上升后下降趨勢,n(EDCI)、n(DMAP)＝1.5∶0.1反應產率最高,為98.5%。

2.1.2 反應溶劑的考察

據文獻[12]報道,常用于酯縮合反應的溶劑有DCM、DMF、THF 等非質子型溶劑,因此將以上溶劑及其混合溶劑作為考察溶劑。實驗固定n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片物質)＝1∶1,縮合劑n(EDCI)、n(DMAP)＝1.5∶0.1,n(反應溶劑)∶n(Boc-L-脯氨酸)＝6∶1 m L/g,反應時間為6 h,考察不同反應溶劑對實驗的影響,結果見圖3。

圖3 溶劑對化合物(5)產率的影響

由圖3可知,以DCM 作為溶劑,反應產率最高,可達85.08%,TLC結果顯示雜質較少。而以DMF、THF、DCM＋DMF、DCM＋THF、DMF＋THF為反應溶劑,產物中雜質較多,產率較低。因此確定DCM 為最優反應溶劑。

2.1.3 反應物投料比和反應時長的考察

縮合劑n(EDCI)∶n(DMAP)＝1.5∶0.1,V(DCM)∶m(Boc-L-脯氨酸)＝6∶1 mL/g,反應時間為6 h,考察n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片)對反應的影響,結果見圖4。由圖4a可知,n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片)＝1.2∶1,產率最高,為97.55%。

圖4 反應物投料比和反應時間對化合物(5)產率的影響

固定n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片)∶n(EDCI)∶n(DMAP)＝1∶1∶1.5∶0.1,V(DCM)∶m(Boc-L-脯氨酸)＝6∶1 m L/g,考察了反應時間對產率的影響,結果見圖4b。由圖4b可知,隨反應時間的增加,目標物產率逐漸增大,當t＝5 h產率趨于平穩,因此確定最佳反應時間5 h。

2.2 Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯合成工藝優化

2.2.1 縮合劑的考察

酰胺化反應較難發生,需加入縮合劑促進反應進行,常見的縮合劑有EDCI、鎓鹽類縮合劑等。其中,EDCI屬于碳二亞胺類縮合劑,在多肽生產中應用較為廣泛,但在進行片段縮合時,易導致消旋,所以通常與DMAP、HOBT 一起使用,以抑制消旋化[11]。鎓鹽類縮合劑活性較高,常用的有HATU、HBTU、PyBOP等,其中PyBOP活性最高,一般在其他方法不反應時使用[11-12],而HATU 活性高于HBTU。DIPEA 則常用作堿配合鎓鹽類縮合劑來催化反應。實驗采用1.2.2的合成方法,固定Boc-L-脯氨酸冰片酯、Boc-L-丙氨酸、2種縮合劑的物質的量之比為1∶1∶1∶1,V(反應溶劑)∶m(Boc-L-丙氨酸)＝12∶1 m L/g,控制反應時間為6 h,對以上的幾種縮合體系進行了篩選,結果見圖5a。

圖5 縮合劑種類和縮合劑用量對化合物8產率的影響

由圖5a可知,實驗選擇的幾種常用縮合體系產率均高于80%的,EDCI和DMAP的組合的產率最高,超過90%,實驗過程中,綜合考察了TLC監控結果和原料的成本等各方面問題,確定EDCI/DMAP為最優縮合體系。

此外考察了EDCI/DMAP 的比例對產率的影響,結果見圖5b。由圖5b 可知,發現隨著EDCI投入量逐漸加大,反應產率表現出先上升后下降趨勢,n(EDCI)∶n(DMAP)＝3∶1反應產率最高,為92.1%。

2.2.2 反應溶劑的考察

以DMAP/EDCI為縮合劑時,常采用的溶劑有DCM、DMF、THF、DMSO,固定n(Boc-L-脯氨酸冰片酯)∶n(Boc-L-丙氨酸)∶n(DMP)∶n(EDCI)＝1∶1∶1∶3,V(溶劑)＝16 m L,t＝6 h,考察常規溶劑及其溶劑之間的混合使用對反應的影響,結果見圖6。

由圖6可知,以上6種情況反應均能夠順利進行,并且產率均高于到80%,其中在V(DCM)∶V(DMF)＝1∶1,混合溶劑中產率最高,為97.02%,因此確定其為最佳反應溶劑。

2.2.3 反應物投料比和反應時長的考察

固定縮合劑n(DMAP)∶n(EDCI)＝1∶3,反應溶劑為16 m L DCM 和DMF 混合溶劑,t＝6 h。反應物投料比和反應時間對化合物8產率的影響見圖7。

圖7 反應物投料比和反應時間對化合物8產率的影響

由圖7a可知,反應物投料比對產率具有顯著的影響,主要表現為隨著Boc-L-丙氨酸量的增加,產率先增后減,n(Boc-L-脯氨酸冰片酯)∶n(Boc-L-丙氨酸)＝1∶1.1產率最高,為97.23%,為最佳投料比。研究發現n(Boc-L-脯氨酸冰片酯)∶n(Boc-L-丙氨酸)分別為1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4時均出現顯著的低極性雜質。由圖7b可知,產率隨著時間推移逐漸增大,t＝6 h后趨于平穩,產率超過97%,故最佳反應時間為6~7 h。

2.3 結構表征

通過核磁共振氫譜和質譜對化合物Boc-L-脯氨酸冰片酯5、Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯8的結構進行表征。

Boc-L-脯氨酸冰片酯5:1H-NMR(400 MHz,Chloroform-d)δ4.95~4.80(m,1 H,f),4.23(ddd,J＝38.3,8.6,2.9 Hz,1 H,e),3.56~3.26(m,2 h,b),2.43~2.02(m,2 h,d),1.93~1.79(m,4 H,g,c),1.73~1.59(m,2 h,g),1.39(s,3 H,a),1.36(s,6 h,a),1.26~1.12(m,2 h,g),0.92(ddd,J＝17.2,14.0,3.4 Hz,1H,g),0.84(d,J＝5.9 Hz,3 H,h),0.80(d,J＝4.8 Hz,3 H,h),0.76(d,J＝6.1 Hz,3H,h)。化合物5的相對分子質量為351.5,質譜檢測獲得m/z＝725.70,為(2M＋Na),相對分子質量符合。

Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯8:1H-NMR(400 MHz,Chloroform-d),δ4.98(ddd,J＝10.1,3.4,2.0 Hz,1 H,h),4.58(dd,J＝8.8,3.7 Hz,1 H,f),4.55~4.40(m,1H,d),3.79~3.59(m,2H,a),2.36(tt,J＝9.8,4.1 Hz,1H,c),2.30~2.22(m,1 H,c),2.05(tdd,J＝12.1,7.9,3.1 Hz,3 H,b,g),1.90(ddd,J＝14.5,9.9,4.4 Hz,1H,b,g),1.80~1.69(m,2 H,b,g),1.45(s,9 H,j),1.38(d,J＝6.8 Hz,3H,i),1.29(dt,J＝7.2,3.8 Hz,2 H,g),1.10~0.94(m,1 H,g),0.91(s,3 H,e),0.89(s,3 H,e),0.83(s,3H,e)。化合物8的相對分子質量為422.6,質譜檢測獲得m/z＝423.40,為(M＋1),相對分子質量符合。

3 結 論

針對丹參素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯合成中的關鍵中間體Boc-L-脯氨酸冰片酯和Boc-L-丙氨酰脯氨酸冰片酸、Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成工藝進行優化。

(1)Boc-L-脯氨酸冰片酯的最優合成工藝為以n(EDCI)∶n(DMAP)＝1.5∶0.1為縮合劑,以DCM 為溶劑,n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片)＝1.2∶1,反應時長5 h。

(2)Boc-L-脯氨酸冰片酸、Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的最優合成工藝為以n(EDCI)∶n(DMAP)＝3∶1作為縮合劑,以DCM 和DMF(1∶1)為溶劑,n(Boc-L-脯氨酸冰片酯)∶n(Boc-L-丙氨酸)＝1∶1.1反應時間為6~7 h。

優化后的縮合工藝,減少了副反應的發生和雜質的升恒,提高了產率,更利于后期的工藝的放大。