甘草次酸差向異構(gòu)體的HPLC檢測(cè)方法研究

張博冉,武秋穎,相 林,惠連旺,劉會(huì)娟,許 可

1.唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系,河北 唐山 063000;2.邁巴克(河北)藥業(yè)有限公司,河北 唐山 063000;3.北京理工大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,北京 100081)

1 引言

目前已知的來自甘草的天然產(chǎn)物超過400種,包含70余種三萜類化合物以及300余種黃酮類化合物[1-3]。三萜類化合物是甘草中的重要成分,具有含量高、生理活性強(qiáng)的特點(diǎn)[4-7]。

甘草次酸(GA)作為甘草酸的苷元,經(jīng)兩步連續(xù)糖基化可以生成甘草酸(GL)[2,8,9]。

由于母核18位手性碳原子(C-18)構(gòu)型的不同,自然界的GA存在兩種差向異構(gòu)體,即18α-甘草次酸(18α-GA)和18β-甘草次酸(18β-GA)[10-16](如圖1所示)。

早期報(bào)道的測(cè)定兩者的方法有TCL法和GC法[17],TCL法靈敏度較低,而GC法需要進(jìn)行復(fù)雜的衍生化。現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中尚未收載18α-GA和18β-GA的分析測(cè)定方法。近年來,陸續(xù)有報(bào)道HPLC法測(cè)定甘草酸差向異構(gòu)體,但這些方法中,有些流動(dòng)相使用磷酸鹽緩沖液,有些使用特殊色譜柱(例如苯基色譜柱)等,適用性較差[18,19]。

本研究采用C18色譜柱建立HPLC法同時(shí)測(cè)定18α-GA和18β-GA的含量。流動(dòng)相為甲醇:10 mmol/L高氯酸水溶液(氨水調(diào)pH=8.2)(78:22v/v),流速1 mL/min。在上述條件下進(jìn)樣測(cè)定,18α-GA和18β-GA分離度較好,并且能夠穩(wěn)定檢測(cè)壓力,該檢測(cè)法專屬性強(qiáng),準(zhǔn)確度高,可用作甘草原料或基因工程菌株產(chǎn)物中差向異構(gòu)體的含量測(cè)定。

2 材料與方法

2.1 儀器

Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀,包括四元泵、全自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和紫外檢測(cè)器。

2.2 試劑

18α-GA標(biāo)準(zhǔn)品(>98%)和18β-GA標(biāo)準(zhǔn)品(>99%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純,試驗(yàn)用水為超純水。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取18α-GA和18β-GA對(duì)照品各50 mg,分別置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液2 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液。

2.4 HPLC檢測(cè)

2.4.1 HPLC檢測(cè)方法

檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為10 mmol/L高氯酸水溶液,氨水調(diào)pH=8.2(二者體積比為78∶22 v/v),流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10μL。

2.4.2 線性關(guān)系及最低檢測(cè)限方法

將對(duì)照品貯備液用流動(dòng)相稀釋成濃度為100,80,60,40,20和10 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按2.4.1所述方法檢測(cè)。

2.4.3 精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試險(xiǎn)

分別取濃度為20 mg/L的18α-GA和18β-GA對(duì)照品溶液,按2.4.1所述方法連續(xù)進(jìn)樣5次,計(jì)算RSD。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測(cè)條件摸索

C18反相色譜柱,4.6 mm×250 mm,粒徑5 μm;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,柱溫:30℃,進(jìn)樣量:10 μL。流動(dòng)相,甲醇:20 mmol/L高氯酸水溶液(氨水調(diào)pH=8.2)(75:25 v/v),流速1.0 mL/min。在上述條件下進(jìn)樣測(cè)定,18α-GA和18β-GA分離度較好,保留時(shí)間分別為24.189 min和26.456 min(圖2)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高氯酸濃度偏高,導(dǎo)致每檢測(cè)5-6個(gè)樣品,色譜柱壓力就急劇升高,不得不進(jìn)行沖洗柱子降低壓力后才能繼續(xù)檢測(cè)。

圖2 HPLC檢測(cè)18α-GA和18β-GA

進(jìn)一步優(yōu)化HPLC檢測(cè)條件為,流動(dòng)相甲醇:水(10 mmol/L高氯酸氨水調(diào)pH=8.2)(75:25 v/v),流速1.0 mL/min。在上述條件下進(jìn)樣測(cè)定,18α-GA和18β-GA分離度較好,保留時(shí)間分別為27.690 min和29.125 min,并且能夠穩(wěn)定檢測(cè)壓力(圖3),但檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng),每個(gè)樣品至少需要40 min左右。

圖3 HPLC檢測(cè)18α-GA和18β-GA

再次優(yōu)化HPLC檢測(cè)條件為,流動(dòng)相甲醇:水(10 mmol/L高氯酸,氨水調(diào)pH=8.2)(78:22v/v),流速1.0 mL/min。在上述條件下進(jìn)樣測(cè)定,18α-GA和18β-GA分離度較好,并且能夠穩(wěn)定檢測(cè)壓力,保留時(shí)間分別為11.321 min和12.865 min(圖4),因此采用該方法進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

圖4 HPLC檢測(cè)18α-GA和18β-GA

3.2 線性關(guān)系及最低檢測(cè)限考察

采用2.4.2所述方法各取溶液上樣并記錄色譜圖。分別以18α-GA和18β-GA的溶液濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸,得到兩者的回歸方程,分別為y=36.989x+235.68,R2=0.990 7;y=36.049x+71.149,R2=0.997 5。結(jié)果表明18α-GA和18β-GA濃度為10～100 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試險(xiǎn)

采用2.4.3所述方法,測(cè)得18α-GA和18β-GA面積的RSD依次為0.5%和0.3%(n=5)。