豬鏈球菌2型核糖核酸酶Ⅲ的克隆表達及催化特性分析

孫文，張永毅，陸暢，朱德文，尹媛媛，徐泉明，2*，陳葉*

(1.福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)，閩臺動物病原生物學福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002；2.福建警察學院，福建 福州 350007)

豬鏈球菌(Streptococcussuis)是一種人畜共患的革蘭陽性兼性厭氧球菌[1]。豬鏈球菌2型(SS2)是諸多血清型中毒力最強、流行最廣、臨床分離率較高的一種血清型，宿主感染后往往呈現腦膜炎、心內膜炎、中毒性休克綜合征等臨床癥狀[2]。

為了快速適應環境的變化，細菌需要調節特定基因的轉錄以及某些RNA的加工、衰變。有研究報道，核糖核酸酶(ribonuclease，RNases)是細菌轉錄后調控的關鍵因子，可以控制各類RNA的降解和穩態水平來維持各項生命活動[3]。在多種細菌中有對RNases催化特性和作用進行探究[4-6]，其中核糖核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ)是一類雙鏈特異性核糖核酸內切酶，廣泛存在于原核生物和真核生物中[7]。細菌RNase Ⅲ可以調節自身mRNA的合成以及特定RNA的降解和成熟[8]，在對數期生長的大腸桿菌中，有超過10%的mRNA穩態水平受RNase Ⅲ調控[9]，多核苷酸磷酸化酶(PNPase)也是一種具有催化切割RNA功能的外切核糖核酸酶，研究發現編碼PNPase的pnpmRNA和編碼RNase Ⅲ的rncmRNA均可被RNase Ⅲ催化降解[10]。在多種細菌研究中發現，RNase Ⅲ的催化活性需要金屬離子的輔助，例如大腸桿菌RNase Ⅲ可在Mg2+或Mn2+催化下選擇性識別并切割雙鏈RNA(dsRNA)[11]。RNase Ⅲ會根據特異性的切割位點切割dsRNA[12]，此外切割位點附近的特定堿基配對模式也可能影響RNase Ⅲ的切割效率[13]。RNase Ⅲ往往特異性催化某些天然或合成的dsRNA，細菌RNase Ⅲ將多種前體RNA，如rRNA、tRNA及sRNA等加工成為成熟RNA[14]。早期研究發現Rc mini RNA和N44 RNA能被大腸桿菌和莢膜紅桿菌RNase Ⅲ特異性切割[15]。同時也有研究表明，RNase Ⅲ的活性影響某些致病菌的形態，Maeda等[16]研究發現谷氨酸棒桿菌RNase Ⅲ可以催化降解mraZmRNA的編碼區來維持細胞形態的穩定。RNase Ⅲ的活性還影響某些致病菌的毒力性狀，尤其在沙門菌中，RNase Ⅲ參與調控生物被膜形成、對宿主定殖和抗生素的敏感性等[8]

在模式細菌大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的研究中，RNase Ⅲ的催化特性已有很多報道，然而關于鏈球菌RNase Ⅲ的研究卻鮮有報道[17-18]。豬鏈球菌是當前廣受重視的人獸共患病原之一，目前尚未見關于豬鏈球菌2型RNase Ⅲ(SS-RNase Ⅲ)的研究報道，因此挖掘其催化特性具有重要意義。本研究對SS-RNase Ⅲ進行了遺傳演化分析和二級結構預測，通過克隆表達SS-RNase Ⅲ并對其進行表征，比較與其他種類細菌RNase Ⅲ在底物催化特性方面的異同，通過比較差異性，進一步了解豬鏈球菌RNase Ⅲ底物催化特異性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SS2野生菌株(05ZYH33)由浙江大學馮友軍教授饋贈，質粒pET28a由本實驗室保存。所用菌株大腸桿菌Top10和大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞、體外轉錄試劑盒(T7高效轉錄試劑盒,貨號:JT101-0)和RNA純化回收試劑盒均購自北京全式金生物有限公司。限制性內切酶和T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司。膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒購自Omega公司。用于PCR擴增和體外轉錄的RNA底物引物序列見表1，16 mer ssRNA、30 mer ssRNA及引物由福州鉑尚生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 SS-RNase Ⅲ遺傳進化及二級結構分析

通過在線生物信息學網站(https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan)預測RNase Ⅲ潛在的氨基酸修飾位點。使用NCBI BLAST對包括豬鏈球菌在內的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的RNase Ⅲ氨基酸序列進行同源性比較，再經多序列比對，遺傳進化樹采用Mega軟件進行繪制。以超嗜熱菌RNase Ⅲ蛋白為模板(PDB：1yz9)進行同源建模，經ESPript 3.0分析處理后得到豬鏈球菌RNase Ⅲ蛋白的二級結構，所用參考序列見表2。

表2 細菌RNase Ⅲ蛋白參考序列

1.3 體外轉錄合成底物RNA及純化

模式底物RNA：RNA 1.1以及細菌內源性底物RNA：5S rRNA、tRNAtyr、tRNAser、rncmRNA、rngmRNA均利用表1中的相關引物經PCR擴增及膠回收獲得用于體外轉錄的DNA模板，再通過體外轉錄試劑盒獲取相關RNA產物。體外轉錄反應體系如下：1 μg模板DNA，4 μL 5×T7轉錄反應緩沖液，8 μL 10 mmol/L NTP Mix，2 μL T7轉錄酶mix，無酶水補至20 μL。充分混勻后于37 ℃金屬浴中反應2 h，隨后添加1 μL DNase I，37 ℃反應15 min，最后添加1 μL 0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)終止反應，利用純化回收體外轉錄試劑盒回收純化RNA產物，最后置于-80 ℃保存。

1.4 重組質粒pET28a-rnc的構建與轉化

以豬鏈球菌05ZYH33基因組DNA為模板擴增RNase Ⅲ編碼的rnc基因，PCR產物經膠回收得到目的DNA片段。用NcoⅠ和EcoRⅠ對質粒pET28a和目的片段進行雙酶切。所用體系為：質粒pET28a或目的片段6 μL，酶切Buffer 1 μL，NcoⅠ和EcoRⅠ各0.5 μL，雙蒸水補至10 μL。于37 ℃水浴酶切4 h，酶切產物分別使用清潔回收試劑盒回收。回收產物連接體系如下：目的基因片段回收產物6 μL，質粒pET28a酶切回收產物2 μL，連接緩沖液1 μL，最后加入T4 DNA連接酶1 μL于16 ℃金屬浴中連接過夜。連接產物轉入大腸桿菌Top10感受態細胞中，輕輕混勻后冰浴放置30 min，42 ℃水浴熱激90 s，繼續冰浴2 min，隨后加入400 μL不含抗生素的LB液體培養基，輕輕混勻后于37 ℃、150 r/min搖床培養1 h，取出菌液以5 000 r/min離心1 min，吸棄200 μL上清液后混勻取適量菌液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養箱中倒置培養16 h，挑取單菌落于600 μL含卡那霉素LB培養基(終濃度為50 μg/mL)中，37℃搖床培養8 h，菌液PCR鑒定為陽性后提取質粒，再經雙酶切鑒定和DNA測序無誤后，將重組質粒轉化至表達菌株大腸桿菌 BL21(DE3)中。

1.5 SS-RNase Ⅲ誘導表達

將陽性菌落轉接于10 mL含卡那霉素的LB培養基中，于37 ℃、180 r/min搖床培養過夜，以1%接菌量至200 mL含有卡那霉素(終濃度為50 μg/mL)LB培養基中，37 ℃、180 r/min搖床培養，待菌液OD600≈0.6時，加入誘導劑IPTG(終濃度為0.2 mmol/L)，18 ℃、150 r/min繼續誘導培養16 h，8 000 r/min離心10 min收獲菌體沉淀，PBS洗滌并重懸沉淀，重懸液高速離心后棄上清液，重復洗滌1次，收集菌體保存于-80 ℃。

1.6 SS-RNase Ⅲ純化

誘導表達后的菌體用40 mL PBS重懸，冰浴超聲破碎菌體細胞(200 W，超聲1 s，間歇3 s，時間10 min)，8 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀(沉淀用等量PBS重懸)，按照1∶5的比例分別加入6×Loading Buffer混勻，煮沸8 min將蛋白變性，經SDS-PAGE進行可溶性分析，檢測目的蛋白分別在上清液和包涵體中的表達情況。使用鎳親和層析柱進一步純化，再經超濾管替換、濃縮得到更高純度的SS-RNase Ⅲ蛋白，最后用12.5%的SDS-PAGE檢測表達量和純度。

1.7 SS-RNase Ⅲ化學交聯反應

設置反應體系為10 μL，將純化后的SS-RNase Ⅲ蛋白與不同濃度(0，2.5，5.0，10.0 μmol/L)的乙二醇雙丁二酰琥珀酸酯(EGS)室溫進行交聯60 min，然后添加50 mmol/L甘氨酸終止反應。通過12.5%濃度的SDS-PAGE以及銀染顯示結果。

1.8 SS-RNase Ⅲ體外催化反應

1.8.1 金屬離子對SS-RNase Ⅲ催化活性的影響

為了探究金屬離子對SS-RNase Ⅲ的輔助催化作用，配制10 mmol/L濃度的不同金屬離子(Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+)催化反應體系(反應體系10 μL)，其中包含30 mmol/L Tris-HCl(pH =7)1 μL，160 mmol/L NaCl 1 μL，0.1 mmol/L DTT 1 μL和500 ng RNA 1.1，最后加入1 μmol/L SS-RNase Ⅲ，此時開始計時；另設置1組不添加SS-RNase Ⅲ為對照組。37 ℃反應15 min和45 min，加入10×RNA Loading Buffer終止反應，通過20%(含7 mol/L尿素)SDS-PAGE檢測催化效果。同時探究不同金屬離子濃度對SS-RNase Ⅲ催化活性的影響，僅更改催化反應體系中金屬離子濃度(0.1、1、5、10、50和100 mmol/L)，其余步驟與上述一致，最后通過SDS-PAGE以及銀染染色檢測催化效果。

1.8.2 pH值對SS-RNase Ⅲ催化活性的影響

為探究pH值對催化活性的影響，向反應體系中加入相同濃度(10 mmol/L)的金屬離子，催化反應體系pH值調整為5、6、7、8、9、10，其余步驟與1.8.1一致，采用SDS-PAGE以及銀染檢測催化效果。

1.8.3 SS-RNase Ⅲ對不同底物RNA的催化反應

確定最適反應體系pH值為7，Mg2+濃度為10 mmol/L，向反應體系施加不同類型RNA底物(16 mer ssRNA、30 mer ssRNA、16：30 dsRNA、30：30 dsRNA、tRNAser、tRNAtyr、5S rRNA、rncmRNA和rngmRNA)，SS-RNase Ⅲ對底物RNA的催化反應過程與1.8.2一致。

2 結果

2.1 SS-RNase Ⅲ序列分析

首先通過在線分析網站比對確定豬鏈球菌05ZYH33菌株基因組上的RNase Ⅲ氨基酸序列，同時結合基因組重測序，結果發現在05ZYH33菌株基因組上的SSU05_1191和SSU05_1192合并為一個開放閱讀框，共同編碼RNase Ⅲ蛋白(圖1)。進一步利用在線軟件Motif Scan解析05ZYH33菌株RNase Ⅲ的氨基酸序列。結果發現，RNase Ⅲ氨基酸序列存在3個磷酸化位點，分別為酪蛋白激酶II磷酸化位點(41～44 aa、137～140 aa)、蛋白激酶C磷酸化位點(211～213 aa)，以及1個N-酰基化位點(13～18 aa)，提示了蛋白質磷酸化可能參與調控RNase Ⅲ的活性。如圖2的結構分析所示，RNase Ⅲ包含2個結構域(催化結構域RⅢD和dsRNA結合結構域dsRBD)，主要通過11個α-螺旋和3個β-折疊連接部分卷曲螺旋的方式形成穩定的二級結構，其中催化基序由ERLEFLGDA共9個保守氨基酸組合而成。

圖1 豬鏈球菌05ZYH33菌株中rnc基因座示意

圖2 RNase Ⅲ蛋白二級結構分析

2.2 SS-RNase Ⅲ同源蛋白比較

選取3種鏈球菌(無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌)、3種葡萄球菌(豬葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌)以及4種不同的革蘭陰性菌(大腸桿菌、超嗜熱菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌)與SS2的RNase Ⅲ進行多序列比對分析。結果顯示，相比于其他細菌，SS2與3種鏈球菌RNase Ⅲ具有極高的同源性(圖2)。此外，遺傳進化分析結果顯示，SS2的RNase Ⅲ與所選3種鏈球菌處于相同遺傳分支，其中親緣關系最近的是肺炎鏈球菌；而與選取的4種革蘭陰性菌親緣關系最遠，位于不同的遺傳分支(圖3)。

注：○為本研究細菌。

2.3 SS-RNase Ⅲ的表達與純化

通過PCR擴增SS-RNase Ⅲ編碼的rnc基因并將其克隆至pET28a載體，雙酶切(NcoⅠ和EcoRⅠ)鑒定，結果條帶與預期大小一致(圖4A)，將該重組表達載體命名為pET28a-rnc，經DNA測序鑒定無誤后將該重組表達載體轉入表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)中，通過IPTG誘導表達SS-RNase Ⅲ，SDS-PAGE分析結果(圖4B)顯示在25 kDa附近出現與預期蛋白大小一致的差異表達條帶。優化表達條件，分析上清液和沉淀，發現在低溫且低誘導劑濃度下外源表達的目的蛋白大部分可溶，但仍有部分以包涵體形式存在(圖4B)。為了獲得純化的SS-RNase Ⅲ，利用SS-RNase Ⅲ蛋白上融合的6×His標簽，使用鎳親和層析柱純化上清液中的目的蛋白，結合超濾管對純化的目的蛋白及緩沖液進行濃縮和替換，SDS-PAGE檢測顯示成功獲取高純度的SS-RNase Ⅲ(圖4C)。

注：A.對重組質粒pET28a-rnc進行雙酶切(NcoⅠ和EcoRⅠ)，其中M為DNA Marker，1為重組質粒pET28a-rnc；B.重組蛋白SS-RNase Ⅲ在大腸桿菌BL21(DE3)的誘導表達及可溶性檢測，其中M為蛋白Marker，1為未添加IPTG條件，2為添加IPTG并低溫誘導條件，3為上清液SS-RNase Ⅲ蛋白，4為沉淀SS-RNase Ⅲ蛋白；C.重組蛋白經純化后SS-RNase Ⅲ的SDS-PAGE檢測，其中M為蛋白Marker，1為SS-RNase Ⅲ。

2.4 SS-RNase Ⅲ的化學交聯分析

RNase Ⅲ內切核糖核酸酶通常作為同源二聚體起作用[4]，為了驗證SS-RNase Ⅲ是否二聚化，將純化后的SS-RNase Ⅲ與不同濃度的交聯劑EGS共同孵育進行化學交聯，SDS-PAGE結果如圖5所示，SS-RNase Ⅲ二聚體會隨著EGS濃度的升高而增加，表明SS-RNase Ⅲ具有與其他RNase Ⅲ同源物相同的二聚化潛力。

M.蛋白Marker；1.未添加EGS；2.添加2.5 μmol/L EGS；3.添加5 μmol/L EGS；4.添加10 μmol/L EGS。

2.5 SS-RNase對金屬離子的依賴性分析

為了探究SS-RNase Ⅲ的催化特性，利用在其他細菌[4，19]中已有報道的具有雙鏈特性的RNA 1.1作為SS-RNase Ⅲ的催化底物，如圖6A所示，RNA 1.1由1個60 nt大小的RNA分子包含1個不對稱(4 nt/5 nt)的內環組成，具有1個一級切割位點(a)和1個二級切割位點(b)。切割a或b單一位點分別產生(13 nt與47 nt)和(19 nt和41 nt)大小的RNA片段，同時切割a和b位點將產生大小為28 nt的RNA片段。

注：A.模式底物RNA 1.1二級結構示意，a和b為2個特異性切割位點；B.添加不同金屬離子(Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+)分別作用0、15、45 min后檢測SS-RNase Ⅲ催化活性變化。

在pH值為7的反應體系中添加10 mmol/L不同的金屬離子(Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+和Cu2+)進行催化反應，催化產物經含7 mol/L尿素的20% SDS-PAGE膠檢測。結果如圖6B所示，僅在添加Mg2+或Mn2+條件下的SS-RNase Ⅲ才具有催化活性，能夠將完整的60 nt的RNA 1.1切割成不同大小的RNA片段，其中在添加Mg2+條件下，出現了大小為28 nt的切割產物，表明Mg2+的存在會導致SS-RNase Ⅲ同時切割RNA 1.1的a和b位點。

進一步通過改變反應體系中Mg2+或Mn2+的濃度，結果如圖7A所示，SS-RNase Ⅲ的催化切割產物的量會隨著Mg2+的濃度升高而增多，且濃度達到5 mmol/L時SS-RNase Ⅲ催化切割活性達到峰值；如圖7B所示，SS-RNase Ⅲ在Mn2+存在下的催化切割活性與Mg2+類似，在Mn2+濃度達到1 mmol/L時其催化切割活性達到峰值。對Mg2+和Mn2+進行比較，發現在5 mmol/L同樣濃度的Mg2+或Mn2+體系中，SS-RNase Ⅲ催化RNA 1.1切割位點不同，產生的小RNA片段不同。研究結果表明，SS-RNase Ⅲ作為一種內切核糖核酸酶發揮作用同樣需要金屬離子的輔助，而且在不同金屬離子體系和反應濃度條件下均顯著影響SS-RNase Ⅲ對 RNA 1.1催化切割位點的偏好性。

注：A.控制反應體系pH值不變，添加不同濃度Mg2+(0.1、1、5、10、50、100 mmol/L)分別作用0、15、45 min后檢測SS-RNase Ⅲ催化活性的變化；B.控制反應體系pH值不變，添加不同濃度Mn2+(0.1、1、5、10、50、100 mmol/L)分別作用0、15、45 min后檢測SS-RNase Ⅲ催化活性的變化。

2.6 不同pH值對SS-RNase Ⅲ催化活性的影響

在多種細菌研究中發現，不同的pH值可以作為影響RNase Ⅲ催化切割活性的因素，因此我們分析了SS-RNase Ⅲ的催化活性是否也受pH值的影響。結果如圖8A所示，在相同濃度Mg2+(10 mmol/L)不同pH條件下，SS-RNase Ⅲ催化切割RNA 1.1的位點出現不同。在酸性或中性條件中，SS-RNase Ⅲ更傾向于同時切割RNA 1.1的a以及b位點(28 nt大小的切割產物條帶更明顯)，表明在Mg2+催化下，不同pH值會影響SS-RNase Ⅲ對底物切割位點的偏好性。然而在相同濃度Mn2+(10 mmol/L)不同pH值條件下，如圖8B所示，SS-RNase Ⅲ僅在酸性及中性環境中表現出較高的催化切割活性，在弱堿性環境中的催化活性并不突出，且隨著pH值升高其催化切割活性逐漸消失。在相同的酸性環境條件下，比較不同金屬離子Mn2+與Mg2+條件下RNase Ⅲ對RNA 1.1的切割位點的偏好，與添加相同濃度Mg2+相比，在金屬離子Mn2+催化作用下，SS-RNase Ⅲ對RNA 1.1的催化切割更偏好b位點(圖8)。研究表明SS-RNase Ⅲ發揮作用時，不同pH值顯著影響了RNase Ⅲ對雙鏈特異性RNA的催化切割位點的偏好性。

注：A.Mg2+濃度為10 mmol/L，在不同pH值(5、6、7、8、9、10)下分別作用0、15、45 min后檢測SS-RNase Ⅲ催化活性的變化；B.Mn2+濃度為10 mmol/L，在不同pH值(5、6、7、8、9、10)下分別作用0、15、45 min檢測SS-RNase Ⅲ催化活性的變化。

2.7 SS-RNase Ⅲ對dsRNA的特異性切割作用

為了更深入地探究SS-RNase Ⅲ的催化特征，利用化學合成單鏈或雙鏈RNA催化底物，包括2個單鏈RNA(ssRNA)：16 mer ssRNA和30 mer ssRNA，以及3種雙鏈RNA：16：16 dsRNA、30：16 dsRNA及30：30 dsRNA。在最佳催化反應體系(10 mmol/L Mg2+，pH=7)中添加這5種催化底物，分析SS-RNase Ⅲ催化切割能力。結果如圖9所示，SS-RNase Ⅲ無法催化切割單鏈RNA(16 mer ssRNA和30 mer ssRNA)，以及底物長度為16 bp的dsRNA(16：16 dsRNA、30：16 dsRNA)，但SS-RNase Ⅲ能夠充分切割長度為30 bp的dsRNA(30：30 dsRNA)，并將其切割成特定的分解產物。以上結果表明SS-RNase Ⅲ對RNA底物的切割具有雙鏈特異性，且催化切割dsRNA的最小長度要求與已研究報道過的大腸桿菌同源RNase Ⅲ也略有不同。

注：在最適反應條件(Mg2+10 mmol/L、pH=7)下分別作用0、15、45、90 min，檢測SS-RNase Ⅲ對不同長度RNA底物(16 mer ssRNA、30 mer ssRNA、16：16 dsRNA、30：16 dsRNA、30：30 dsRNA)的催化活性。

2.8 SS-RNase Ⅲ對不同內源性RNA催化切割特性

研究表明細菌RNase Ⅲ具有降解或加工多種內源性RNA(如rRNA、tRNA和mRNA等)的功能[4]。因此，為了驗證SS-RNase Ⅲ對自身編碼的內源性RNA催化切割特性，本試驗通過體外轉錄的方式獲取多種豬鏈球菌內源性RNA，包括1種rRNA(5S rRNA)、2種tRNA(tRNAtyr、tRNAser)以及2種mRNA(rnc、rng)。結果如圖10所示，在最適催化條件下(Mg2+10 mmol/L、pH=7)，SS-RNase Ⅲ對2種tRNA轉錄本催化切割效率較弱，可充分催化切割mRNA(rnc)，難以切割mRNA(rng)，對5S rRNA具有一定催化能力。以上結果表明SS2多種內源性RNA轉錄本受SS-RNase Ⅲ催化切割能力影響且具有不同的催化效率。

3 討論

近年來，越來越多的研究表明核糖核酸酶Ⅲ作為細菌全局性調控網絡的催化因子[20]，具有識別并切割dsRNA的功能，在多種細菌中被認為是病原菌致病過程的一種關鍵因素[21]。RNase Ⅲ作為一種在細菌中廣泛存在的金屬離子依賴性的雙鏈特異性內切核糖核酸酶，在細菌的生命活動及致病過程中具有重要作用，但只在少數細菌中如大腸桿菌進行了表征和功能研究[22]，并且目前還沒有對于豬鏈球菌RNase Ⅲ的深入研究。本研究對來自豬鏈球菌2型的RNase Ⅲ同源物進行了表征及催化特性分析。

研究發現SS-RNase Ⅲ與已有報道的大腸桿菌RNase Ⅲ催化特性部分相似[23]，只有Mg2+或Mn2+可以輔助SS-RNase Ⅲ對底物的催化作用，而Ca2+同樣不支持催化作用，推測可能與Ca2+具有較大的半徑和不同的配體配位特性有關[24]。與苜蓿中華根瘤菌RNase Ⅲ[4]不同的是，更高濃度(>5 mmol/L)的Mn2+反而抑制了SS-RNase Ⅲ的催化活性，并且SS-RNase Ⅲ似乎更依賴Mg2+的輔助催化作用；而與苜蓿中華根瘤菌RNase Ⅲ類似的是，Mn2+使得SS-RNase Ⅲ對b位點切割更具有專一性。值得注意的是，在其他研究中發現金屬離子(Mg2+、Mn2+、Zn2+等)的存在可能會導致非特異性切割位點的產生[4，25-26]，因此推測，結果中出現的某些非特異性切割產物可能是反應體系中存在的Mg2+或Mn2+將RNA底物片段化所產生的。總體而言，這些發現證實了SS-RNase Ⅲ在模式底物RNA 1.1上具有嚴格金屬輔因子依賴性。此外，細胞內pH值變化可以影響酶活性，在布魯菌或芽胞桿菌中，RNase Ⅲ只有在pH值大于7的堿性緩沖液環境中才能表現催化活性[25，27]，然而在Mn2+催化條件下，SS-RNase Ⅲ對RNA 1.1的催化活性則會隨著堿性逐漸加強而消失，因此推測金屬離子在不同酸堿環境下調節SS-RNase Ⅲ活性可能有助于細菌應對環境脅迫。此外不同pH值催化條件下，SS-RNase Ⅲ的底物切割產物也存在差異，因此猜測酸堿環境的變化可能影響了SS-RNase Ⅲ對RNA 1.1切割位點的偏好性。RNase Ⅲ已被證明能夠在體外切割具有雙鏈特征的RNA，包括細菌自身編碼或非編碼的RNA[28]，在大多數細菌如苜蓿中華根瘤菌及大腸桿菌中，RNase Ⅲ僅能降解dsRNA，并且對內源性RNA底物表現出不同的偏好[4]，而毛霉菌RNase Ⅲ還可切割單鏈RNA[22]。本研究發現，與大腸桿菌RNase類似，SS-RNase Ⅲ不能切割外源性的ssRNA，能夠有選擇性地催化切割dsRNA，并且針對不同類型的豬鏈球菌內源性RNA(rncmRNA、rngmRNA、5S rRNA和tRNA)具有不同的切割效率，表明SS-RNase Ⅲ對內源性的多種RNA轉錄本的加工存在差異性，可為該酶的進一步開發利用提供參考依據。

綜上所述，本研究通過克隆純化得到的SS-RNase Ⅲ具有與其他細菌RNase Ⅲ家族成員相似的催化特征，通常以二聚體的形式存在，具有較嚴格的金屬輔助因子依賴性，能夠識別并催化切割部分特定的dsRNA結合基序。然而，在催化反應條件或催化RNA底物不同時，豬鏈球菌RNase Ⅲ與其他種類細菌RNase Ⅲ的催化特性存在差異。以上結果為進一步探究RNase Ⅲ在豬鏈球菌中的調控作用奠定了基礎，也為了解RNase Ⅲ在細菌中的催化特性提供了參考依據。