2株鴨源H10N6亞型禽流感病毒的遺傳進化分析及其致病性研究

朱峻鋒，劉朔，尹馨，彭程，劉華雷，蔣文明，3*，張傳美*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東 青島 266109；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東 青島 266032；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物安全風險預(yù)警及防控重點實驗室(南方)，山東 青島 266032)

禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)是正黏病毒科、A型流感病毒屬，一般僅感染禽類，有些AIV能越過物種界限進行擴散，并引起人類及其他哺乳動物的疾病或亞臨床感染[1-3]。依據(jù)AIV在SPF雞中致病性，可以將其分為高致病性AIV與低致病性AIV兩種類型[4]。

目前，在野生水禽中已經(jīng)鑒定出16種血凝素(HA)和9種神經(jīng)氨酸酶(NA)亞型，并從蝙蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了H17N10、H18N11兩種亞型[3]。1949年H10N7亞型AIV在德國雞群中首次分離。隨后，在許多鳥類、哺乳類動物中均有不同程度的分布，其中包括家雞、水貂等。之后，H10亞型AIV在各國家禽及野鳥間蔓延傳播，并且在此期間病毒不斷地重組導(dǎo)致宿主范圍不斷擴大[5]。瑞典于1984年報道了H10N4亞型AIV感染了哺乳動物雪貂，造成大批死亡，且結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒PB2蛋白出現(xiàn)K526R與D701N的哺乳動物適應(yīng)性相關(guān)突變現(xiàn)象[6]。2003年從我國湖北省豬體內(nèi)首次分離出H10N5亞型AIV[7]。2010年，澳大利亞報道了多例臨床癥狀明顯的人感染H10N7病毒病例[8]。2013年在我國江西省首次出現(xiàn)人類感染H10N8亞型AIV死亡案例，感染試驗結(jié)果顯示，病毒可在小鼠肺組織中高效復(fù)制[9]。多項研究表明，H10亞型AIV可以跨物種侵染哺乳動物并有可能進一步發(fā)生適應(yīng)性突變，對人類健康構(gòu)成威脅。2021年4月江蘇省報告了第1例人感染H10N3亞型禽流感病毒案例，研究表明這種新型重組病毒對小鼠具有高致病性，存在人類感染的風險[10]。

持續(xù)監(jiān)測、了解和探索已知和新型AIV并評估其對動物和人類健康的潛在影響是疫病防控的前提。本實驗室在2020年全國主動流行病學調(diào)查中，在鴨的口咽拭子中分離到2株H10N6亞型AIV，對這2株分離到的病毒進行了全基因組測序、遺傳演化分析及動物感染試驗，分析該病毒的生物學特性，評估該病毒的公共衛(wèi)生風險，以期對國內(nèi)H10亞型禽流感綜合防治工作有所借鑒。

1 材料與方法

1.1 病毒及實驗動物

A/duck/Fujian/F1464/2020(H10N6)(簡稱F1464)、A/duck/Fujian/F1473/2020(H10N6)(簡稱F1473)由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心分離鑒定并保存；6周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司；6周齡SPF雞和SPF雞胚均購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 主要試劑

病毒核酸提取試劑盒購自濟凡生物科技(常州)有限公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA膠純化試劑盒購自索萊寶公司。

1.3 病毒全基因組測序及遺傳演化分析

根據(jù)病毒RNA提取試劑盒的說明書，對2株H10N6亞型AIV進行RNA提取，以它為模板，參照Hoffmann等[11]的引物和反應(yīng)條件，分別用RT-PCR方法擴增基因組中各個目的節(jié)段。在此基礎(chǔ)上通過比較不同核酸片段大小和長度來判斷該樣品是否為禽流感病毒樣本。對擴增產(chǎn)物進行純化、測序和鑒定。測序結(jié)果采用DNAStar軟件Seqman Pro拼接序列。

下載GenBank和GISAID數(shù)據(jù)庫中AIV基因組序列，在MEGA 11.0中用Clustal W法比較病毒各基因片段序列，通過Neighbor-Joining構(gòu)建了8條基因片段遺傳進化樹，Bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.4 病毒純化和雞胚半數(shù)感染量(EID50)測定

2株病毒用PBS按10倍倍比稀釋，稀釋度為10-6～10-9，接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度分別接種5次。37 ℃孵育48 h后，收集稀釋度最大、血凝價最高的雞胚尿囊液，按照上述操作步驟，如此循環(huán)純化3代后，再將收集到的尿囊液進行分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r，取出-80 ℃保存的純化的含病毒尿囊液并10倍倍比稀釋，每個稀釋度分別接種5枚10日齡SPF雞胚并在37 ℃條件下孵化48 h，統(tǒng)計各稀釋度具有血凝活性的雞胚數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計算各毒株EID50。

1.5 靜脈接種指數(shù)(IVPI)測定

病毒在生理鹽水中10倍稀釋后，每羽SPF雞用0.1 mL稀釋后的病毒液進行翅下靜脈注射，每組10只，感染后對試驗雞的臨床癥狀和死亡情況進行持續(xù)10 d的觀察與記錄。IVPI為每只雞在10 d內(nèi)的臨床觀察得分平均值，24 h內(nèi)動物完全死亡為3分，10 d內(nèi)動物完全無癥狀為0分，出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)相關(guān)癥狀、精神沉郁、腹瀉、頭冠紫紅、頭面水腫、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為1分。IVPI超過1.2，則判定為高致病性AIV[12]。

1.6 小鼠感染性試驗

6周齡雌性BALB/c小鼠經(jīng)干冰麻醉后，用106EID50的病毒劑量通過鼻腔感染小鼠8只，每只接種50 μL尿囊液。在攻毒后14 d內(nèi)，每天監(jiān)測小鼠的疾病體征、體重變化(相對于攻毒前的體重變化)和死亡情況以初步鑒定該病毒對機體的影響。病毒感染后3 d，每組隨機選擇3只小鼠進行剖殺，分別取小鼠的腦、鼻甲、脾臟、腎臟和肺臟，用雞胚滴定各臟器內(nèi)病毒含量。各種組織臟器經(jīng)勻漿機勻漿后，2 000g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到滅菌離心管中，用含抗生素的無菌PBS進行10倍比稀釋，每個稀釋接種3枚10日齡的雞胚，根據(jù)Reed-Muench法計算病毒滴度，以測定病毒在小鼠體內(nèi)各臟器的復(fù)制水平。

2 結(jié)果

2.1 鴨源H10N6亞型AIV的序列與遺傳演化分析

為了明確本研究中2株H10N6病毒的起源，首先對全基因組進行測序，并對HA和NA以及其他6個基因片段進行遺傳進化分析(圖1和圖2)。結(jié)果表明，2株H10N6病毒HA基因均屬于歐亞譜系。BLAST分析結(jié)果表明，這2株H10N6的HA基因與浙江毒株A/chicken/Zhejiang/102622/2016(H10N8)最相似，NA基因與A/duck/Vietnam/HN5894/2019(H4N6)的關(guān)系最為密切。

注：▲和■表示不同年份人感染的H10毒株；●為本試驗分離毒株，下同。

圖2 兩毒株P(guān)A、NP、M和NS基因片段遺傳進化分析

PB2、PB1、PA、M、NS、NP基因與2013年以來從中國、韓國、越南等國家的家禽中分離出的各種亞型AIV密切相關(guān)(表1)。HA序列分析結(jié)果顯示，2株H10N6亞型AIV的HA基因之間的同源性為99.8%，與2013年的人感染H10N8亞型AIV和2021年的人感染H10N3亞型AIV同源性分別為91.4%～91.5%和95.3%～95.4%。經(jīng)由對上述試驗結(jié)果的分析，2株鴨源H10N6亞型AIV與2013年的H10N8亞型AIV有較遠的親緣關(guān)系，與2021年的H10N3亞型AIV親緣關(guān)系較近。

表1 2株H10N6亞型AIV各基因節(jié)段同源性分析

2.2 IVPI

2株H10N6亞型AIV靜脈感染SPF雞后，感染組10只雞在10 d內(nèi)無任何可見臨床癥狀出現(xiàn)，因此判定F1473和F1464毒株的IVPI均為0，為低致病性AIV。

2.3 BALB/c小鼠致病性試驗

以106EID50的劑量將2株H10N6亞型AIV各感染8只小鼠，3 d后滴定不同臟器內(nèi)的病毒滴度，結(jié)果顯示(圖3)，2株病毒在小鼠肺臟及鼻甲中的平均滴度分別為1.5 lg～4.5 lg EID50/mL和3.25 lg～6.92 lg EID50/mL，2株病毒在小鼠的大腦及腎組織中均未被發(fā)現(xiàn)。在14 d觀察期內(nèi)，F(xiàn)1473毒株組與對照組相比小鼠體重上升較慢，而F1464毒株組在感染后4 d出現(xiàn)明顯的體重下降(圖4)。體重變化與臟器病毒滴定結(jié)果一致，F(xiàn)1464毒株組不僅在鼻甲和肺臟中的病毒滴度比F1473毒株組高，脾臟中也監(jiān)測到病毒復(fù)制。

圖3 小鼠感染兩毒株3 d后各臟器病毒滴度

圖4 小鼠感染14 d內(nèi)體重變化

3 討論

自1997年以來，H5和H7亞型禽流感引起了全世界的關(guān)注，不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，還導(dǎo)致了上千人的感染病例[13]。近年來，一些其他亞型的AIV也出現(xiàn)了人感染病例，如H10、H3等。H10亞型AIV的傳入對人類健康構(gòu)成潛在威脅，其不斷重組和感染引起了人們對H10亞型AIVs的更多關(guān)注，但目前世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的H10N6亞型禽流感病毒樣本較少。

2020年，本實驗室在全國的主動流行病學調(diào)查中，從鴨體內(nèi)分離出2株H10N6亞型AIV。遺傳進化和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這2株分離株屬于歐亞譜系，是由多個亞型的AIV重組而來。根據(jù)遺傳進化分析結(jié)果，這些重組最有可能發(fā)生在中國、越南和韓國，因為這2株H10N6亞型AIV的基因與中國、越南和韓國分離毒株親緣關(guān)系最近。可能是家禽體內(nèi)H10N8流感病毒與越南的H4N6亞型AIV重組后，又繼續(xù)與其他流感病毒進行重組，并通過一系列重組獲得其他流感病毒的內(nèi)部基因，提示這2株H10N6亞型AIV可能是由包括H1、H2、H3、H4、H9、H10和H11在內(nèi)的多種AIV亞型重組而來，其原因可能是攜帶病毒的野鳥在東亞至澳大利亞的遷徙過程中與東亞其他國家的病毒發(fā)生了重組。由于來自野生鳥類的AIV很少直接感染人類，與其他家禽甲型流感病毒重組可能使它們具有某些基因特征從而感染人類。

BALB/c小鼠致病性試驗結(jié)果表明，2株H10N6亞型AIV可以感染小鼠，并在小鼠呼吸系統(tǒng)(肺臟和鼻甲)中有效復(fù)制，但均不能突破小鼠血腦屏障在其腦內(nèi)增殖。病毒在多系統(tǒng)的復(fù)制和滴度的高低決定了毒株的致病力不同，F(xiàn)1464毒株的致病力強于F1473毒株，出現(xiàn)一過性的體重下降。這2株H10N6病毒在下呼吸道(肺)中復(fù)制的滴度高于上呼吸道(鼻甲)，說明病毒具備結(jié)合人樣受體的能力。

隨著病毒的不斷進化，H10亞型病毒可能會導(dǎo)致潛在的人類感染風險問題，因此應(yīng)加強對H10亞型AIV的監(jiān)測，逐步深化拓展對其生物學特性的相關(guān)研究，以此更好地服務(wù)于國內(nèi)流感疫情防控和預(yù)警預(yù)報等工作。