豬薩佩羅病毒HNHB-01株 VP1基因的表達(dá)與分子特征

李朝陽，郝晨琳，曾權(quán)，馬洪濱，祖少坡，3，胡慧，3，張紅壘，3*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心，北京 100071；3.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

豬薩佩羅病毒(porcine sapelovirus，PSV)屬單股正鏈RNA病毒，沒有囊膜結(jié)構(gòu)，2014年國際病毒分類委員會(huì)(ICTV)將其歸為微RNA病毒科薩佩羅病毒屬[1-5]。該病毒傳播迅速，通過消化道擴(kuò)散、蔓延，亦可通過豬相互接觸傳播。各年齡段豬均可感染PSV，以仔豬感染最為嚴(yán)重。發(fā)病后會(huì)出現(xiàn)各種臨床癥狀，如腦脊髓灰質(zhì)炎、繁殖障礙、腹瀉、肺炎等。PSV在臨床上易與其他病毒混合感染，如豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndr-ome virus，PRRSV)和豬細(xì)小病毒(porcine parvovi-rus，PPV)等[6]，導(dǎo)致病情復(fù)雜嚴(yán)重，大量仔豬死亡，降低了同期生豬出欄率，嚴(yán)重制約了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

PSV基因組大小為7.5～8.3 kb，僅有1個(gè)開放閱讀框，編碼1個(gè)多聚蛋白[7-9]。PSV的蛋白結(jié)構(gòu)組成與其他微RNA病毒類似，VP4、VP2、VP3和VP1組成了該病毒的衣殼[10]，其中VP2、VP3、VP1蛋白均位于核衣殼外部，發(fā)揮主要的抗原效應(yīng)，而短的VP4蛋白則位于核衣殼內(nèi)部，不參與免疫應(yīng)答[11]。RNA病毒的衣殼蛋白可保護(hù)病毒RNA不被環(huán)境中的RNA酶水解，以及將病毒RNA包裝進(jìn)入衣殼和將病毒RNA釋放到宿主細(xì)胞的功能[12]。此外，病毒衣殼蛋白還可通過與宿主細(xì)胞膜上的受體結(jié)合介導(dǎo)最初的感染，決定宿主的范圍；與整合素受體結(jié)合從而激發(fā)受體途徑或線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[13-14]。

上世紀(jì)60年代，PSV在英國暴發(fā)[15]，而后在中國、西班牙、巴西、韓國等國家迅速傳播[12，16-18]，截至目前，相關(guān)疫苗或抗病毒藥物尚未被研發(fā)。我國PSV呈現(xiàn)多發(fā)、散發(fā)態(tài)勢(shì)，近年來該病毒檢出率不斷提高，嚴(yán)重影響生豬生產(chǎn)性能，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大損失。PSV在傳播疾病的同時(shí)常常伴隨著VP1基因的變異。VP1蛋白作為核衣殼組成成分之一，具有免疫原性，可作為血清學(xué)檢測方法建立的候選蛋白。此外，VP1蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，而中和抗體水平是研發(fā)疫苗的關(guān)鍵性指標(biāo)之一，因此VP1是研發(fā)PSV疫苗的理想候選蛋白[19-21]。

本研究利用真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)VP1蛋白，并通過構(gòu)建PSV遺傳進(jìn)化樹，揭示了PSV在全球范圍內(nèi)的流行情況，進(jìn)一步以VP1基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建進(jìn)化樹，分析HNHB-01株與參考毒株間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，隨后對(duì)VP1進(jìn)行同源性分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測。本研究不僅為PSV的診斷與預(yù)防提供依據(jù)，并且為今后研究VP1基因的功能和開發(fā)疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒

豬薩佩羅病毒HNHB-01株由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要材料

人胚腎上皮細(xì)胞(HEK-293T)、pCAGGS載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京擎科生物科技有限公司；PSV VP1單抗由本實(shí)驗(yàn)室制備；FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自SIGMA公司；2×RapidTaqMaster Mix、DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司；NEBT4 DNA連接酶、NEBSmaⅠ、NEBXhoⅠ內(nèi)切酶均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；DNA凝膠回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.3 主要儀器

NanoDrop-2000超微量紫外分光光度儀購自美國Thermo Forma公司；PCR核酸擴(kuò)增儀購自美國Thermo公司；電泳儀購自北京六一儀器廠；紫外凝膠成像系統(tǒng)購Proteinsimple公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

基于GenBank上載錄的PSV(登錄號(hào)：MN939541)基因序列，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)靶向VP1基因的特異性引物(表1)，送至武漢奧科公司合成。

表1 VP1基因的引物序列

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

用TRIzol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增VP1基因，反應(yīng)總體系為25 μL：2×RapidTaqMaster Mix 13 μL，ddH2O 9 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)。通過瓊脂糖凝膠電泳，膠回收純化PCR產(chǎn)物，然后利用SmaⅠ和XhoⅠ對(duì)pCAGGS載體和VP1基因進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物回收純化，利用T4 DNA連接酶將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受狀態(tài)細(xì)胞，在含有Amp+的LB培養(yǎng)皿上37 ℃培養(yǎng)14～16 h，挑取白色單菌落，利用通用引物進(jìn)行PCR鑒定，隨后提取重組質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，篩選出陽性重組質(zhì)粒，送至武漢奧科公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pCAGGS-VP1。

1.6 Western blot檢測 VP1 蛋白表達(dá)

首先將pCAGGS-VP1轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染36 h后吸棄培養(yǎng)液，用 1 mL 預(yù)冷 PBS 洗細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，置于冰上10 min，收集VP1蛋白于EP管中，加入 25 μL 5×SDS loading buffer，95 ℃加熱 10 min。經(jīng)12% SDS-PAGE后，在400 mA 1 h條件下將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上；使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；以鼠源VP1單克隆抗體作為一抗，4 ℃過夜孵育；以TBST 緩沖液清洗5 次，每次5 min，然后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG二抗，室溫孵育2 h；以TBST 緩沖液清洗5 次，每次 5 min；最終使用ECL成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

1.7 間接免疫熒光(IFA)檢測 VP1 蛋白表達(dá)

以HEK-293T細(xì)胞鋪設(shè)12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長至80%時(shí)，將pCAGGS-VP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，36 h后吸棄維持液，用PBS洗滌2次，以預(yù)冷的無水乙醇4 ℃固定過夜；加入5% BSA室溫封閉2 h；以鼠源VP1單克隆抗體作為一抗，4 ℃孵育過夜；以0.05% PBST洗5次，每次5 min，然后加入1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h；以0.05% PBST洗5次，每次5 min；加入含DAPI的封片劑染細(xì)胞核，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 基于PSV全基因組遺傳進(jìn)化分析

從NCBI中選擇各個(gè)國家具代表性的毒株序列，共33株(表2)，運(yùn)用MEGA 7軟件的Neighbor-Joining算法(鄰系接合法)，基于Bootstrap method參數(shù)模式，自展值設(shè)置為1 000個(gè)重復(fù)，將HNHB-01毒株序列與NCBI上下載的32株毒株序列進(jìn)行比對(duì)，而后建立PSV全基因組遺傳進(jìn)化發(fā)育樹。

表2 PSV HNHB-01與其他PSV參考毒株信息

1.9 基于VP1基因遺傳進(jìn)化分析

運(yùn)用MEGA 7軟件的Neighbor-Joining算法，基于Bootstrap method參數(shù)模式，自展值設(shè)置為1 000個(gè)重復(fù)，從表2挑選17株參考毒株，建立VP1基因的遺傳進(jìn)化樹，并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析。

1.10 基于VP1抗原表位氨基酸突變的分析

應(yīng)用DNAMAN軟件對(duì)代表性參考毒株P(guān)SV VP1蛋白氨基酸序列與HNHB-01 VP1蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，分析抗原表位氨基酸的突變情況。

1.11 VP1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

登陸在線網(wǎng)址http://www.iedb.org/對(duì)VP1蛋白的抗原表位進(jìn)行預(yù)測，然后登陸在線網(wǎng)址https://swissmodel.expasy.org/，預(yù)測VP1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 pCAGGS-VP1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增 VP1基因，獲得了879 bp的VP1基因條帶(圖1A)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單菌落，通過PCR篩選出含有VP1目的基因的菌落，隨后提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，酶切產(chǎn)物出現(xiàn)2條帶，其中879 bp處有目的條帶，符合預(yù)期結(jié)果(圖1B)。進(jìn)一步測序結(jié)果表明，PSV VP1基因被成功構(gòu)建入pCAGGS載體中。

M1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1.VP1基因PCR產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照；M2.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL5000；3.雙酶切產(chǎn)物；4.陰性對(duì)照；5.VP1基因PCR產(chǎn)物

2.2 Western blot和IFA檢測VP1蛋白表達(dá)

將空載體pCAGGS和重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h后裂解細(xì)胞，通過Western blot檢測蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示(圖2A)，表達(dá)的VP1蛋白為36 kDa，符合預(yù)期結(jié)果。而后將空載體pCAGGS(陰性對(duì)照)和重組質(zhì)粒pCAGGS-VP1分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，36 h后通過間接免疫熒光檢測VP1蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖2B)，陰性組未見綠色熒光，而試驗(yàn)組存在大量綠色熒光。以上試驗(yàn)表明VP1蛋白成功表達(dá)。

M.蛋白Marker；1.轉(zhuǎn)染pCAGGS空載體HEK-293T細(xì)胞裂解物；2.轉(zhuǎn)染pCAGGS-VP1質(zhì)粒HEK-293T細(xì)胞裂解物。

2.3 基于PSV全基因組遺傳進(jìn)化分析

為揭示PSV在全球范圍內(nèi)的流行情況，應(yīng)用MEGA 7軟件的Neighbor-Joining算法，將HNHB-01株和從NCBI上下載的32株參考毒株建立遺傳進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果顯示，所有的PSV全基因序列被分為2個(gè)大的亞群：GroupⅠ和GroupⅡ，實(shí)驗(yàn)室分離的HNHB-01株位于GroupⅠ-2，與2017年分離的HNXX-01株親緣關(guān)系較近，其次與2017年流行的JXXY-a2株、2016年流行的PSV-A2株關(guān)系較近，說明河南毒株與2016—2017年流行的毒株可能為同一來源，而與2015年流行的HUN1株關(guān)系較遠(yuǎn)，與中國當(dāng)前2019—2021年流行的毒株SHCM2019、PSV2020、GS01關(guān)系較遠(yuǎn)，同時(shí)與中國首次分離毒株csh關(guān)系更遠(yuǎn)，說明HNHB-01株與中國其他地區(qū)分離株進(jìn)化程度具有差異，我國PSV存在地區(qū)間交叉感染。另外HNHB-01株與日本株JPSV-1315關(guān)系接近，而與印度株、韓國株、美國株、意大利株、英國株等處在不同的亞分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，推測我國PSV可能從日本傳入。

注：●代表HNHB-01株。

2.4 基于VP1基因遺傳進(jìn)化分析

研究表明，微RNA病毒VP1基因變異性最大，容易發(fā)生突變和缺失，所以進(jìn)一步以PSV的外層衣殼蛋白VP1基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建進(jìn)化樹，分析HNHB-01株VP1基因與17株參考毒株VP1基因間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。如圖4所示，PSV VP1基因序列被分為2個(gè)大群：GroupⅠ和GroupⅡ，其中GroupⅠ又分為GroupⅠ-1、GroupⅠ-2兩大亞群，HNHB-01 VP1基因位于GroupⅠ-1，與國內(nèi)2016—2017年流行的毒株HNXX-01、PSV-A2、JXXY-a2的VP1基因高度同源，而與HNXX-01株VP1基因位于同一分支，與國外2009年流行的日本毒株JPSV1315的VP1基因親緣關(guān)系較近，推測我國PSV可能為日本傳入，與印度株同屬GroupⅠ-1亞群，具有一定的親緣關(guān)系，但與韓國、美國、意大利等國外毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。值得注意的是，HNHB-01株VP1基因與2019—2020年國內(nèi)流行SHCM2019株、PSV2020株VP1基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明PSV在長期流行傳播過程中，出現(xiàn)一定程度的變異，地緣性特征明顯，HNHB-01株與當(dāng)前國內(nèi)PSV流行株存在明顯遺傳分化，研發(fā)疫苗時(shí)可考慮選擇流行株為對(duì)象，以期提高疫苗保護(hù)力。

注：●代表HNHB-01株VP1。

2.5 基于VP1抗原表位氨基酸突變的分析

為了研究VP1蛋白特征，將16株參考毒株的PSV VP1基因編碼的氨基酸序列與HNHB-01株VP1氨基酸序列的抗原表位區(qū)進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示，2016—2017年國內(nèi)流行的4株毒株(HNHB-01、HNXX-01、PSV-A2、JXXY-a2)的VP1氨基酸高度同源，均不存在氨基酸的插入和缺失，但存在部分突變。HNHB-01株與HNXX-01株VP1氨基酸同源性最高，為99.32%；HNHB-01株VP1氨基酸與PSV2020株VP1氨基酸同源性最低，為80.13%；PSV-A2株VP1氨基酸序列與JXXY-a2株VP1氨基酸序列完全一致，表明兩者來源為同一祖先。

與國內(nèi)4株P(guān)SV分離株的VP1氨基酸相比，SHCM2019株VP1氨基酸共有24處突變，而PSV2020株的VP1氨基酸共有33處突變，且在B、C區(qū)域有一高變區(qū)，兩者共同突變有16處，散布于A、B、C 3個(gè)區(qū)域。值得注意的是，PSV2020株的VP1氨基酸在第287～290存在連續(xù)4個(gè)氨基酸插入，這可能會(huì)影響PSV整體的功能(圖5)。與2001年世界上首次分離的英國株V13 VP1氨基酸對(duì)比，國內(nèi)4株P(guān)SV分離株的VP1氨基酸共有20處共同突變，以上數(shù)據(jù)表明近年來VP1蛋白變異頻率越來越快。VP1蛋白作為PSV中核衣殼的組分之一，不僅可誘導(dǎo)產(chǎn)生高中和抗體，而且在病毒入侵增殖過程發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PSV VP1蛋白的主要抗原表位在10～70 aa、90～105 aa、155～170 aa、205～215 aa、230～240 aa、265～285 aa 處，其中最優(yōu)勢(shì)抗原位點(diǎn)位于20～30 aa、90～100 aa、265～275 aa，氨基酸變異位點(diǎn)主要集中在10～70 aa、205～285 aa區(qū)段。本研究分析出的集中突變區(qū)正好位于此區(qū)域內(nèi)，VP1蛋白抗原表位區(qū)域氨基酸的突變是導(dǎo)致其毒力及抗原性發(fā)生改變的根本原因。以上種種數(shù)據(jù)表明，2019年后中國PSV流行株與國內(nèi)其他分離株相比存在明顯變異，出現(xiàn)了PSV變異株。

圖5 VP1蛋白氨基酸序列分析

2.6 VP1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

衣殼蛋白VP1與病毒逃逸宿主免疫有關(guān)，對(duì)致病性尤為關(guān)鍵。對(duì)VP1蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，以期進(jìn)一步了解VP1蛋白功能。首先登錄網(wǎng)址http://www.iedb.org/對(duì)VP1蛋白抗原表位進(jìn)行預(yù)測，VP1蛋白存在多個(gè)潛在的抗原表位(如圖6A)，挑選出3條最優(yōu)勢(shì)抗原表位氨基酸序列，然后登陸在線網(wǎng)址https://swissmodel.expasy.org/，利用SWISS-MODEL程序進(jìn)行同源建模，預(yù)測VP1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，在所預(yù)測的VP1蛋白上，標(biāo)記并放大3條抗原表位對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，分別為20～30 aa、90～100 aa、265～275 aa(圖6B)。結(jié)果顯示，3條抗原表位區(qū)對(duì)應(yīng)的氨基酸均位于蛋白結(jié)構(gòu)外側(cè)，更易與抗體結(jié)合。Ramachandran評(píng)價(jià)顯示蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性均良好，表明預(yù)測結(jié)果成功。此次預(yù)測縮小了定位表位的范圍，為抗體制備、免疫檢測提供了一定的理論基礎(chǔ)。

圖6 VP1抗原表位分析(A)與VP1蛋白的三維預(yù)測模型(B)

3 討論

近年來，PSV在中國豬場廣泛分布[21]，致死率較低，但感染性較高，且常和豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬細(xì)小病毒等混合感染，引起豬群生產(chǎn)性能下降，使中國養(yǎng)豬企業(yè)和養(yǎng)殖戶蒙受巨大損失。迄今為止，尚無針對(duì)PSV的疫苗或藥物投入市場，伴隨著PSV檢出率的逐年升高，亟需開展有關(guān)PSV的研究。

本研究采用PCR方法，擴(kuò)增出PSV衣殼蛋白VP1基因，并成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pCAGGS-PSV-VP1，為今后研究VP1蛋白功能以及疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，通過對(duì)我國PSV構(gòu)建遺傳進(jìn)化發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，HNHB-01株與HNXX-01株遺傳進(jìn)化關(guān)系最為接近，二者均分離于河南，其次與2016—2017年流行的PSV-A2、JXXY-a2中國株關(guān)系最近，而與中國2019—2021年流行的毒株SHCM2019、PSV2020、GS01關(guān)系較遠(yuǎn)，與中國首次分離毒株csh關(guān)系更遠(yuǎn)，說明HNHB-01株與中國其他地區(qū)分離株進(jìn)化程度具有差異，我國PSV存在地區(qū)間交叉感染。另外，HNHB-01株與日本株JPSV-1315存在一定親緣性，可能為日本傳入，與英國、韓國、美國、印度分離株遺傳距離較遠(yuǎn)。

由于PSV基因組和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，常常伴隨著VP1基因的變異。本研究結(jié)果分析表明，2016—2017年國內(nèi)流行的4株毒株(HNHB-01、HNXX-01、PSV-A2、JXXY-a2)的VP1氨基酸高度同源，并且PSV-A2株VP1氨基酸序列與JXXY-a2株VP1氨基酸序列完全一致，表明兩者來源為同一祖先。與國內(nèi)4株P(guān)SV分離株的VP1氨基酸相比，SHCM2019株VP1氨基酸共有24處突變，PSV2020株的VP1氨基酸共有33處突變，且氨基酸變異位點(diǎn)散布于抗原表位區(qū)，甚至PSV2020株的VP1氨基酸在第287～290存在連續(xù)4個(gè)氨基酸插入。而與世界上首次分離的英國株V13 VP1氨基酸對(duì)比，國內(nèi)4株P(guān)SV分離株的VP1氨基酸共有20處共同突變。這些氨基酸的改變可能導(dǎo)致抗原性發(fā)生改變，對(duì)PSV生物學(xué)特性的意義還有待進(jìn)一步的研究。