鴨坦布蘇病毒prM蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位鑒定

劉亞林，梁真潔，楊興淼，曹瑞兵

(南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095)

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒(duck Tem-busu virus，DTMUV)引起的一種以商品蛋鴨、肉種鴨采食量、產蛋量驟然大幅下降為主要臨床特征，以出血性卵巢炎為主要病變特征的急性傳染病。DTMUV可感染不同日齡鴨，患病鴨還會出現嚴重的神經癥狀，如共濟失調、癱瘓等[1-2]。2010年我國首次暴發鴨坦布蘇病毒病，其感染率可高達100%，死亡率可達10%～30%。該病可危害鴨、番鴨、鵝、蛋雞、鴿、麻雀等多種禽類，給我國禽類養殖業帶來嚴重危害[3-4]。DTMUV屬于黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群。病毒粒子呈球形，病毒基因組為單股正鏈RNA，一個ORF編碼的前體蛋白經病毒和宿主蛋白酶水解后形成3個結構蛋白及7個非結構蛋白，即核衣殼蛋白(C)、膜前體蛋白(prM)和囊膜蛋白(E)及NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5[5]。其中prM 蛋白含167個氨基酸，主要存在于感染細胞內未成熟的病毒粒子中，可被細胞中的弗林蛋白酶切割成pr片段(92 aa)和M蛋白(75 aa)，病毒在宿主細胞內的裝備過程中，prM 參與病毒囊膜的組成，對病毒復制及維持空間結構起重要作用[6]。

目前針對鴨坦布蘇病毒prM蛋白結構和功能的研究較少。本試驗首先利用DNASTAR系統分析發現，DTMUV XZ2012株prM蛋白前153個氨基酸抗原性及疏水性較好，故將該基因片段克隆到表達載體，在大腸桿菌中進行誘導表達并鑒定，然后以純化后的重組prM蛋白做免疫原免疫BALB/c小鼠，應用雜交瘤細胞融合技術，成功篩選獲得了2株穩定分泌抗DTMUV-prM的單克隆抗體，確定了單抗識別的抗原表位區域，為今后研究鴨坦布蘇病毒prM蛋白結構、功能及病毒的致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

鴨坦布蘇病毒XZ2012株由本實驗室分離、鑒定和保存。pET-28a(+)質粒、pET-32a(+)質粒、大腸桿菌DH5α感受態細胞、大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞、BHK-21細胞及SP2/0小鼠骨髓瘤細胞均由本實驗室保存。SPF級雌性BALB/c小鼠和ICR雌性小鼠(5～6周齡)購自揚州大學實驗動物中心。

高保真酶2×PrimeSTAR Max Premix購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；180 kDa Prestained Protein Marker購自諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性核酸內切酶BamHⅠ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher Scientific公司；BCA蛋白質定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；RPMI 1640培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；羊抗鼠IgG(H+L)-HRP購自碧云天生物技術有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)-羊抗鼠IgG、小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自Proteintech生物科技有限公司；TanonTMHigh-sig ECL Western blot底物試劑盒購自天能科技有限公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、細胞融合劑PEG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT和HT購自美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 重組質粒構建

參考GenBank數據庫中DTMUV XZ2012(GenBank：KM188953.1)毒株的prM基因序列設計引物，prM-F：5′-GCGGATCCATGCTGAAGCTTGGAA-ATTATAA-3′，含有BamHⅠ酶切位點(下劃線處)；prM-R：5′-TGCTCGAGTATCTTTTGGCTTCTCGTCG-3′，含有XhoⅠ酶切位點(下劃線處)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，用于擴增prM基因，目的基因大小為459 bp。以提取的DTMUV XZ2012株基因組RNA為模板，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板PCR擴增prM基因。PCR反應條件：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸5 min。將目的片段和pET-28a(+)載體經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切回收，然后用T4 DNA連接酶進行連接。將連接產物轉化至DH5α感受態中，細菌經抗性單克隆培養、PCR和雙酶切鑒定，正確后送通用生物系統公司測序，將測序正確的質粒命名為pET28a-prM，置-20 ℃保存備用。

1.3 prM蛋白的誘導表達及純化

將重組質粒pET28a-prM轉化至BL21感受態中，置于含卡那霉素的LB液體培養基中培養至菌液OD600 nm為0.4～0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，于37 ℃、200 r/min搖床誘導表達4 h。將誘導后菌體進行超聲波破碎，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀，通過SDS-PAGE鑒定目的蛋白表達形式。用His鎳柱純化目的蛋白，利用BCA法測定目的蛋白濃度，重組prM蛋白分裝后置-80 ℃保存備用。

1.4 重組蛋白prM單克隆抗體制備

1.4.1 動物免疫

取5只5～6周齡雌性BALB/c小鼠，將純化的重組prM蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混勻乳化，通過皮下多點注射方式免疫小鼠，60 μg/只。二免、三免用弗氏不完全佐劑乳化，每次免疫間隔2周，第3次免疫后1周對小鼠進行尾靜脈采血，分離血清，用間接ELISA方法測定血清抗體效價。融合前3 d選取抗體效價最高的小鼠進行加強免疫，腹腔注射重組蛋白，60 μg/只。

1.4.2 單克隆抗體制備

加強免疫后3 d，將小鼠安樂死并分離脾細胞，在PEG4000作用下與對數生長期的SP2/0細胞按照7∶1的比例進行細胞融合。將融合細胞鋪至含有HAT選擇培養基的96孔細胞板中培養。細胞融合7 d后觀察96孔板中細胞融合情況，取有雜交瘤細胞生長的細胞培養上清液100 μL，用間接ELISA進行檢測。陽性雜交瘤細胞需進行2～3次亞克隆。將穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株擴大培養、凍存于液氮中長期保存。

1.4.3 間接ELISA檢測抗體

將重組prM蛋白用碳酸鹽抗原包被液稀釋至2 μg/mL包被酶標板，4 ℃包被過夜，用5%脫脂乳于37 ℃封閉2 h。將雜交瘤細胞培養上清液加入酶標板，同時將小鼠血清按1∶1 000稀釋設立陰、陽性對照，于37 ℃反應1 h；用PBST洗滌3次，加入100 μL羊抗鼠IgG(H+L)-HRP(1∶6 000稀釋)于37 ℃反應1 h；用PBST洗滌3次，每孔加入100 μL TMB顯色液，于37 ℃避光顯色10 min；加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應。為了排除載體自身誘導表達的蛋白影響檢測結果，試驗采用pET28a-vp70重組質粒誘導表達的蛋白作為抗原包被酶標板，用制備的抗體孵育進行反檢。用酶標儀測定每孔OD450 nm值，待檢樣品OD450 nm/陰性樣品OD450 nm(P/N)>2.1判定為陽性，其陽性孔對應的抗體最大稀釋倍數即為該抗體的效價。

1.4.4 小鼠單抗腹水的制備

選取7周齡雌性BALB/c小鼠，先向小鼠腹腔內注射500 μL無菌液體石蠟。7 d后，向小鼠腹腔注射3×106～4×106個雜交瘤細胞。5～7 d后，觀察小鼠腹部變大、觸之有波動感、行動不敏捷、被毛粗糙時收集腹水，4 000 r/min離心5 min，取中間層，置-80 ℃長期保存備用。

1.5 單克隆抗體生物學特性鑒定

1.5.1 單克隆抗體分泌穩定性及亞型測定

將陽性雜交瘤細胞連續傳代培養20代，每隔5代凍存一批細胞，利用ELISA測定不同代次細胞上清液的抗體效價。使用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒按照說明書方法鑒定單克隆抗體亞型。

1.5.2 Western blot鑒定單抗

分別取DTMUV感染BHK-21細胞和JEV感染BHK-21細胞樣品，先進行SDS-PAGE，然后轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF膜)上。5%脫脂奶粉封閉，以雜交瘤細胞上清液作為一抗，進行Western blot。以BHK-21細胞作為陰性對照，鑒定prM單克隆抗體反應的特異性。

1.5.3 間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定單抗

用DTMUV感染BHK-21細胞，以未感染DTMUV的細胞作為對照，培養36 h后用4%多聚甲醛固定，用PBS(pH=7.2)洗滌3次，用0.1%的Triton 100作用15 min；洗滌后每孔加入含有2%牛血清白蛋白(BSA)PBS 200 μL，于37 ℃封閉2 h；洗滌后每孔加入200 μL雜交瘤細胞培養上清液，于37 ℃反應1 h；洗滌后每孔加入200 μL FITC-羊抗鼠IgG(用PBS進行1∶200稀釋)，37 ℃反應1 h，用PBS重復洗滌3次，將細胞板置于熒光顯微鏡下觀察，使用EVOS FL細胞成像系統拍攝照片并保存。

1.5.4 微量病毒空斑減少中和試驗

將BHK-21細胞接種于6孔板中，待細胞長至細胞孔80%左右時，將單克隆抗體細胞上清液在56 ℃水浴滅活處理30 min，用DMEM培養液按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80進行倍比稀釋，然后將稀釋成200 TCID50/mL的病毒液與等量倍比稀釋的單克隆抗體細胞上清液均勻混合，37 ℃孵育1 h，接種BHK-21細胞，72 h后觀察空斑形成情況。

1.6 單抗識別B細胞抗原表位的鑒定

利用IEDB(http://www.iedb.org/home_v3.php)分析prM蛋白序列抗原特性，預測單克隆抗體的B細胞表位，然后將prM蛋白進行逐步截短并克隆至pET-32a(+)載體中。以制備的單克隆抗體3H4和5C10為一抗，通過Western blot鑒定prM單克隆抗體所識別的抗原表位區域。

1.7 抗原表位氨基酸位點比對分析

選擇不同來源的DTMUV 16個代表毒株的prM基因序列以及同屬黃病毒中的日本腦炎病毒(JEV)、登革熱病毒(DENV)和西尼羅病毒(WNV)的prM基因序列，利用BioEdit軟件比對prM蛋白氨基酸序列，分析B細胞抗原表位序列在各毒株中的保守性。

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增及重組質粒的構建

通過PCR擴增的prM目的基因片段大小為459 bp，與理論值相符(圖1)。將構建的重組質粒pET28a-prM進行雙酶切鑒定，酶切后的基因片段與目的基因大小一致，基因測序結果正確，無任何突變。

M.DNA Marker；1～4.prM基因PCR產物；5.pET28a-prM 重組質粒；6.pET28a-prM 雙酶切產物。

2.2 重組 prM 蛋白表達與純化

重組菌BL21-prM經IPTG誘導后成功表達，在20 kDa大小處有明顯條帶，SDS-PAGE結果顯示與預期大小相符，將誘導后的全菌超聲裂解后發現重組蛋白主要以包涵體形式表達(圖2A)。通過使用鎳柱親和層析純化，利用不同濃度咪唑洗脫得到單一條帶的重組prM蛋白(圖2B)。

M.蛋白分子量標準；1.空載體誘導全菌蛋白；2.重組質粒誘導表達全菌蛋白；3.重組質粒誘導表達后上清液；4.重組質粒誘導表達后沉淀；5～13.純化的重組prM蛋白(5為過柱前重組prM蛋白，6～10為200 mmol/L咪唑洗脫得到重組prM蛋白，7～13為300 mmol/L咪唑洗脫得到重組prM蛋白)。

2.3 小鼠血清抗體效價測定

小鼠第3次免疫后10 d，通過尾靜脈采血，利用間接ELISA檢測小鼠血清抗體效價(圖3)。與陰性小鼠相比，免疫組的所有小鼠均表現出較高水平的prM蛋白抗體效價，血清抗體效價均大于1∶25 600。選取抗體效價最高的1號小鼠，取脾細胞與SP2/0細胞融合制備雜交瘤細胞。

圖3 間接ELISA檢測小鼠血清效價

2.4 DTMUV prM單克隆抗體制備及效價測定

采用間接ELISA篩選出2株能穩定分泌抗DTMUV prM蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別命名為3H4和5C10。將2株陽性雜交瘤細胞進行連續傳代至20代，用ELISA檢測細胞上清液抗體效價穩定(表1)，同時用2株陽性雜交瘤細胞制備小鼠腹水，其中5C10抗體效價為1∶102 400，3H4抗體效價為1∶51 200。

表1 雜交瘤細胞上清液和腹水ELISA抗體效價測定

2.5 DTMUV prM單克隆抗體亞型鑒定

單克隆抗體亞型鑒定結果表明：3H4和5C10單克隆抗體的重鏈均屬于IgG2b亞類，輕鏈均為Kappa型(表2)。

表2 單克隆抗體亞型鑒定

2.6 DTMUV prM單克隆抗體 Western blot 反應性鑒定

Western blot鑒定結果顯示，2株單克隆抗體3H4和5C10均能特異性識別DTMUV接種BHK-21細胞中大小約為20 kDa的病毒蛋白，與prM蛋白大小一致(圖4A)，而這2株單克隆抗體均不與JEV接種的BHK-21發生特異性反應(圖4B)，表明所制備的這2株單克隆抗體均能特異性識別DTMUV prM蛋白，而與JEV沒有交叉反應。

M.蛋白分子量標準；1.DTMUV感染的BHK-21細胞樣品；2、4.正常細胞對照；3.JEV感染的BHK-21細胞樣品。

2.7 DTMUV prM單克隆抗體IFA反應特性鑒定

IFA結果顯示：單克隆抗體3H4和5C10均能與DTMUV感染的BHK-21細胞發生反應，產生特異性的綠色熒光，陽性細胞中抗體熒光分布在細胞質，與DTMUV prM在細胞中的表達和分布一致，而經單克隆抗體處理的對照組BHK-21細胞均未見特異性熒光(圖5)。表明這2株單克隆抗體均能特異性結合DTMUV，具有良好的反應原性和特異性。

圖5 抗prM蛋白單克隆抗體與DTMUV的IFA反應特性鑒定(200×)

2.8 DTMUV prM單克隆抗體病毒中和活性測定

通過空斑減少試驗測定單克隆抗體3H4和5C10的中和活性(圖6)，在等量病毒液中加入不同稀釋度的抗體作用后，細胞孔中病毒感染空斑個數出現變化，意味著病毒的數量發生了變化。通過Reed-Muench法計算單克隆抗體的中和效價，3H4和5C10的中和效價分別為1∶34和1∶11.5，這表明單克隆抗體3H4和5C10具有一定的中和活性。

1～5.單抗細胞上清液稀釋比例分別為1∶1、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀釋；6.DMEM對照。

2.9 prM蛋白截短體的表達及B細胞抗原表位的鑒定

為了探究單克隆抗體3H4和5C10識別的抗原表位區域，首先將prM片段截斷分成2個片段prM1～81 aa和prM70～153 aa，成功誘導表達后通過3H4和5C10單克隆抗體Western blot反應性鑒定，發現2株單克隆抗體均與前段prM1～81 aa反應。為了進一步分析單克隆抗體3H4和5C10識別的抗原表位，先在后段prM70～153 aa的基礎上逐步向前加10個氨基酸構建出5個截短體prM60～153 aa、prM50～153 aa、prM40～153 aa、prM30～153 aa和prM20～153 aa，將以上截短體誘導表達后通過3H4和5C10單克隆抗體Western blot反應性鑒定，同時設立空載誘導菌體作為陰性對照。Western blot反應性鑒定結果顯示(圖7A)，mAb 3H4與重組蛋白prM40～153 aa、prM30～153 aa和prM20～153 aa有效結合，但不能與prM50～153 aa和prM60～153 aa蛋白結合，而mAb 5C10與重組蛋白prM50～153 aa、prM40～153 aa、prM30～153 aa和prM20～153 aa有效結合，但不能與prM60～153 aa蛋白結合。為進一步確定表位所在區域，通過將前段基因序列進行逐步截短，構建出截短體prM1～50 aa、prM1～55 aa、prM1～60 aa、prM1～65 aa和prM1～70 aa，Western blot反應性鑒定結果顯示(圖7B)，mAb 3H4可以和重組蛋白prM1～55 aa、prM1～60 aa、prM1～65 aa、prM1～70 aa反應，而與重組蛋白prM1～50 aa不反應；mAb 5C10可以和prM1～60 aa、prM1～65 aa和prM1～70 aa反應，而與重組蛋白prM1～50 aa和prM1～55 aa不反應。綜上根據2次截短體的鑒定結果，繪制抗原表位鑒定示意圖(圖7C)及簡化示意圖(圖7D),可以證明mAb 3H4的抗原識別區域大概為第40～55位氨基酸,即40DVGLMCQDDITYLCPK55,mAb 5C10的抗原識別區域大概為第50～60位氨基酸，即50TYLCPKLEYGY60。

注：A.單抗與截短體蛋白Western blot結果，其中M為蛋白分子量標準，1為 L1截短體，2～6分別為R1～R6截短體，9為L6截短體，10為L5截短體，11為L4截短體，12為L3截短體，13為L2截短體，8、14為pET-32a；B.單抗識別抗原表位鑒定示意及判定結果，+表示有反應，-表示不反應。

2.10 DTMUV等黃病毒pr蛋白抗原表位氨基酸位點比對分析

通過利用BioEdit軟件比對DTMUV的不同毒株和黃病毒屬中其他病毒如：JEV、DENV、WNV的pr蛋白氨基酸序列，結果發現(圖8)：第40～60位氨基酸之間的這2個抗原表位區域，在DTMUV不同毒株間無氨基酸差異，保守性較高；DTMUV與DENV和WNV差異較大，推測DTMUV的prM蛋白單克隆抗體與其應該無交叉反應；DTMUV與JEV存在7個氨基酸差異，推測這7個氨基酸是導致這2株prM蛋白單克隆抗體與JEV無交叉反應的關鍵氨基酸。

圖8 DTMUV等黃病毒prM蛋白氨基酸序列分析

3 討論

本研究成功制備了2株針對DTMUV-prM的單克隆抗體3H4和5C10，小鼠腹水抗體效價分別為1∶51 200和1∶10 2400，3H4和5C10單克隆抗體的重鏈均屬于IgG2b亞類，輕鏈均為Kappa型；Western blot反應性鑒定試驗顯示，2株單克隆抗體均能與DTMUV感染的BHK-21細胞發生特異性反應，而與JEV沒有交叉反應性，均在20 kDa處出現prM蛋白大小的預期條帶，這說明細胞內的病毒多數以未成熟病毒粒子的形式存在；IFA反應性鑒定試驗顯示，2株單克隆抗體均能夠識別DTMUV感染的BHK-21細胞，同時通過空斑減少中和試驗結果發現這2株單克隆抗體具有一定的中和活性，證明制備的這2株單抗具有重要應用價值；而且鑒定出這2株單抗針對prM的不同表位，均分別位于pr部分，其中mAb 3H4的抗原位點識別區域為第40～55位氨基酸，mAb 5C10的抗原位點識別區域為第50～60位氨基酸，這為后續建立檢測方法和研究DTMUV的生物學功能奠定了基礎。

目前，對DTMUV等一些重要黃病毒的E、NS1、NS5等蛋白進行了深入研究[7-11]，然而針對DTMUV prM蛋白功能的研究還非常有限，僅見Huang等[12]制備了3株針對prM蛋白的單克隆抗體，且沒有進行中和試驗和抗原表位的鑒定。本研究針對prM蛋白獲得的3H4和5C10單克隆抗體能特異性識別DTMUV，與JEV無交叉反應。利用DNASTAR軟件對DTMUV、JEV、WNV、DENV等黃病毒的prM第40～60位抗原表位區域進行氨基酸序列比對，發現不同DTMUV毒株之間在prM這一抗原表位區域無差異，保守性較高，而DTMUV與JEV有7個氨基酸的差異，說明JEV這7個氨基酸對抗體表位的識別起著關鍵作用，與WNV和DENV差異較大。這些結果提示：針對DTMUV prM蛋白的單克隆抗體僅能特異性識別DTMUV，對于多種黃病毒共存地區，在黃病毒感染的血清學研究中具有潛在的應用價值，為后續建立ELISA檢測方法提供了物質基礎。

黃病毒的prM蛋白被弗林蛋白酶裂解是激活產生成熟的具有感染性病毒粒子的必要條件[13-15]，prM未裂解的病毒粒子進入細胞后會使E蛋白不能順利和內體膜融合，從而影響病毒基因組的釋放，prM蛋白的裂解程度將影響病毒復制和毒力。在病毒成熟的過程中，prM蛋白會被切割為pr部分和M蛋白，pr部分對于E蛋白在內質網的再加工及E蛋白最后的組裝均起著重要作用[16-17]；M蛋白參與病毒囊膜的構成，與插入脂雙層E蛋白的完全疏水C端相互作用，在細胞內對E蛋白進行折疊、修飾和裝配，可誘生具有輕度中和作用的抗體，與病毒核心組成具有感染性的病毒粒子。本研究發現3H4和5C10單克隆抗體能特異性識別DTMUV的pr部分，而且具有一定的病毒中和活性，因為黃病毒弗林蛋白酶介導的prM蛋白裂解通常是不完全的，可在細胞外檢測到未成熟、部分成熟和成熟病毒顆粒混合物[18-19]，因此單克隆抗體可以和病毒粒子暴露出來的prM蛋白結合，起到一定的中和作用。本試驗發現針對DTMUV prM蛋白的單克隆抗體具有中和活性，而prM蛋白誘導中和抗體產生的功能域，prM蛋白對病毒入侵、組裝和釋放的影響機制及prM蛋白與其宿主分子之間的相互作用均有待進一步的研究。

綜上，本研究通過雜交瘤細胞融合技術獲得2株單克隆抗體，為建立DTMUV檢測方法和研究prM蛋白生物學功能提供了物質基礎。