非洲豬瘟病毒p54蛋白單抗制備及B細胞線性抗原表位鑒定

陳艷，龍云鳳，姜焱，周斌*

(1.南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2.南京海關動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210019)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)能導致家豬和野豬的出血熱，強毒株致死率可達到100%。該病毒具有相當高的跨境傳播能力，在非洲、歐洲、美洲和亞洲廣泛流行。疫情對豬肉產業的影響嚴重，導致全球豬肉供需失衡及價格大幅波動，世界動物衛生組織(WOAH)將非洲豬瘟(ASF)列為法定報告動物疫病，我國也將之歸入必須重點防范的一類動物疫病名錄。近期，ASFV疫苗的研發和臨床應用推廣取得了一定進展，但要想徹底控制病毒傳播仍需全球合作和共同努力[1-3]。

ASFV是一種雙鏈的核質大DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDV)，基因組長度為170～190 kb，編碼68種結構蛋白和超過100種非結構蛋白[4]。內膜蛋白p54與p30、p72被證實為最具抗原性和免疫原性的ASFV結構蛋白，能夠誘導產生中和抗體[5]。針對p54的抗體最早出現在感染后第8 天，并持續存在數周，因此，p54及其抗體常被作為血清學診斷靶點，用于監測動物ASFV感染情況和免疫效力評估[6]。本研究將ASFV Pig/HLJ/2018毒株(GenBank號：MK333180)E183L(p54)基因的膜內區序列插入到pET-28a(+)載體，通過原核表達系統獲得ASFV重組p54蛋白，借助雜交瘤技術制備出3株針對p54蛋白的單克隆抗體，并利用噬菌體展示肽庫鑒定了3株抗體所識別的抗原表位，為ASFV診斷方法開發和病原學基礎研究提供了生物學工具。

M.DNA Ladder；1.陰性對照；2.p54基因；3～5.p54-pET-28a-DH5α重組菌單克隆；6.pET-28a空載體；7.重組質粒 pET-28a-p54。

M.蛋白 Marker；1.pET-28a-BL21全菌；2.未誘導p54-pET-28a-BL21全菌；3～5.經誘導的p54-pET-28a-BL21全菌及裂解后的上清液、沉淀；6.流穿液；7～10.含50、100、200、300 mmol/L咪唑的洗脫液。

M.蛋白 Marker；1.pET-28a-BL21；2.p54-pET-28a-BL21。

M.蛋白 Marker；1.未感染的PAM細胞；2.ASFV感染的PAM細胞；3～6.依次為PRRSV、CSFV、JEV和ASFV感染細胞裂解物。

1 材料與方法

1.1 主要材料

攜帶ASFV Pig/HLJ/2018毒株E183L(p54)基因的質粒pGEX-4T-1-p54購自南京金斯瑞生物科技有限公司；ASFV感染的豬肺泡巨噬細胞(PAM)爬片和SDS-PAGE樣品由中國農業科學院蘭州獸醫研究所惠贈；ASFV陽性血清標準品購自中國獸醫微生物菌種保藏中心；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、日本腦炎病毒(JEV)、抗p30蛋白單克隆抗體、小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)由本實驗室保存；BALB/c小鼠購自江蘇華創信諾醫藥科技有限公司。

高保真PCR聚合酶Prime STAR、限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ、DNA Ladder、T4 DNA連接酶和DNA膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；pET-28a(+)載體由本實驗室保存；質粒提取試劑盒購自Omega公司；感受態細胞DH5α和BL21(DE3)購自北京擎科生物技術有限公司；6×His-tag Ni親和層析柱購于General Electric公司；250 kDa預染蛋白 Marker、12.5% PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司；180 kDa預染蛋白 Marker、BCA蛋白濃度測定試劑盒、高敏型ECL化學發光檢測試劑盒購自南京諾唯贊醫療科技有限公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自PALL公司；HRP標記兔抗鼠IgG、FITC標記羊抗鼠IgG、His單克隆抗體、小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自Proteintech公司；TMB底物和終止液購自碧云天生物技術有限公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清購自Gibco公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT和HT培養基購自Sigma公司；Ph.D-12肽庫試劑盒、抗M-13抗體購自NEB公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 重組質粒的構建與鑒定

實驗室前期試驗表明，全長的p54蛋白難以在原核系統中表達，因此選擇對其進行截短表達。根據TMHMM-2.0的蛋白質跨膜區預測結果，針對p54蛋白的膜內區(157～555 bp，53～183 aa)設計常規PCR引物，F：5′-TGACGGATCCATGTCTTCAAG-AAAGAAAAAAGC-3′(下劃線處為BamHⅠ酶切位點)，R：5′-TGACCTCGAGCAAGGAGTTTTCTAG-GTCT-3′(下劃線處為XhoⅠ酶切位點)，擴增產物長度為399 bp。以質粒pGEX-4T-1-p54為PCR模板。反應體系為：Prime STAR 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min。通過膠回收方法純化PCR產物。

將經過限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ處理后的目的片段和pET-28a(+)載體用T4連接酶連接8 h。之后轉化連接產物到感受態細胞DH5α中，從菌液PCR鑒定為陽性的單克隆過夜培養物中提取質粒，對重組質粒進行限制性雙酶切，陽性質粒由北京擎科生物技術有限公司測序。測序正確的重組質粒被命名為pET-28a-p54并于-20 ℃保存。

1.3 重組p54蛋白的原核表達、純化及反應原性鑒定

將重組質粒pET-28a-p54轉化到感受態細胞BL21(DE3)中，得到p54重組蛋白原核表達菌株p54-pET-28a-BL21。將p54-pET-28a-BL21的過夜培養物按體積比1∶100接種到含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，在37 ℃、200 r/min條件下培養至對數生長期，即菌液的OD600值為0.6～0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，繼續培養5～7 h后離心收集菌體。用PBS重懸菌體后在冰浴條件下進行超聲破碎，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min。轉移上清液到新的離心管，并用PBS重懸沉淀，分別制備SDS-PAGE樣品，用以鑒定重組蛋白的表達形式。

使用His-tag鎳離子親和層析法純化重組蛋白。在預試驗中用梯度咪唑濃度的洗脫緩沖液洗脫，經SDS-PAGE測定重組蛋白的最佳洗脫濃度。后續試驗洗脫時先用低咪唑濃度的除去雜蛋白，再用最佳濃度的緩沖液洗脫下重組蛋白。用SDS-PAGE鑒定重組蛋白的純度。用透析法對純化后的重組蛋白做脫鹽和濃縮處理。用BCA法測定重組蛋白的濃度。通過Western blot鑒定重組蛋白與His單克隆抗體、ASFV陽性血清標準品的反應性。

1.4 p54蛋白單克隆抗體制備

1.4.1 動物免疫

將10只6周齡BALB/c雌性小鼠平均分為免疫組和陰性對照組。首次免疫時，以背部皮下多點注射方式給免疫組每只小鼠接種50 μg重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑的乳化物。首次免疫后的第3周進行第2次免疫，第4周進行第3次免疫。第2、3次免疫時將弗氏完全佐劑換成弗氏不完全佐劑。整個免疫程序中，陰性對照組用等體積滅菌PBS處理。第3次免疫后7 d，采集小鼠眼眶血，通過間接ELISA測定小鼠血清效價。細胞融合前3 d，在效價達到1∶10 000的小鼠中選擇數值最高的那只，腹腔注射100 μg重組蛋白。

1.4.2 單克隆抗體的制備

細胞融合前1 d，分離小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養細胞，密度調整到1×105/mL，按100 μL每孔加入到96孔板中培養。處死經過4次免疫的小鼠，分離脾細胞，在PEG4000作用下與對數生長期的SP2/0細胞按照5∶1的比例進行細胞融合。將融合細胞用含1× HAT和20% FBS的選擇培養基重懸，加入到含有飼養細胞的96孔細胞板中培養。細胞融合3 d后，每日觀察細胞狀態并統計融合率。細胞融合第5天后，每隔3 d用HAT選擇培養基半換液。細胞融合第14天后，用HT補充培養基半換液，取出的一半細胞培養上清液用間接ELISA方法測抗體水平，對陽性雜交瘤細胞至少進行2～3次亞克隆至抗體陽性率達100%，確立雜交瘤細胞系并建庫凍存，之后培養不再添加HT補充培養基。將陽性雜交瘤細胞連續傳代培養和凍存，逐代減少FBS含量至10%、5%甚至無血清，以利于抗體產生和后續抗體純化。測定不同代次的細胞培養物上清液中抗體效價，擴大培養能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株，凍存于液氮中長期保存。

1.4.3 間接ELISA方法

用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH=9.6)作為包被液將重組蛋白p54稀釋到2 μg/mL，按100 μL/孔加入到酶標板，37 ℃孵育1 h。之后用PBST洗滌4次，最后一次洗滌完將酶標板在吸水紙上拍干。用5%脫脂乳作為封閉液，按100 μL/孔加入到酶標板，37 ℃孵育1 h。按前述方法洗滌。將陰性對照、陽性對照和樣品，按100 μL/孔加入到酶標板，37 ℃孵育45 min。按前述方法洗滌。將HRP標記山羊抗鼠IgG單抗以1∶5 000比例稀釋后，按100 μL/孔加入到酶標板，37 ℃孵育45 min。按前述方法洗滌。按100 μL/孔加入TMB顯色液，37 ℃避光顯色15 min。按100 μL/孔加入終止液。使用酶標儀讀取OD450 nm值，待檢樣品OD450 nm/陰性樣品OD450 nm(S/N)≥2.1時判定為陽性。以PBS處理組的小鼠血清作為陰性對照，免疫組小鼠血清作為陽性對照。

1.4.4 腹水制備

準備9只12周齡BALB/c雌性小鼠，按3只/株單克隆抗體分組。給每只小鼠腹腔注射0.5 mL經高壓滅菌的液體石蠟。7 d后，給每只小鼠腹腔接種5×105個雜交瘤細胞。5～7 d后，每日觀察小鼠狀態，對腹部明顯膨大、觸摸有波動感的小鼠用0.55 mm靜脈采血針收集腹水。采集到的腹水在4 ℃靜置過夜，次日12 000 r/min離心5 min，收集中間層，于-80 ℃保存備用。

1.5 p54蛋白單克隆抗體的生物學特性鑒定

1.5.1 Western blot鑒定單克隆抗體的反應性

取感染ASFV的PAM細胞裂解物，進行SDS-PAGE并轉印到PVDF膜上，以雜交瘤細胞上清液作為一抗，進行Western blot反應性鑒定。設立未感染ASFV的PAM細胞作為陰性對照。

1.5.2 免疫熒光試驗(IFA)鑒定單克隆抗體的反應性

鑒定抗p54單克隆抗體與感染ASFV的PAM細胞的反應性，設立未感染ASFV的PAM細胞作為陰性對照。用4%多聚甲醛固定細胞，加入2% BSA在37 ℃封閉2 h，以雜交瘤上清液作為一抗、HRP標記山羊抗鼠IgG為二抗，在37 ℃各孵育1 h，每個步驟之后用PBS洗滌3次。在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.3 單克隆抗體的反應特異性鑒定

取PRRSV、CSFV、JEV和ASFV感染的PAM細胞裂解物，進行SDS-PAGE并轉印到PVDF膜上，以3株雜交瘤細胞上清液混合液作為一抗，進行Western blot反應特異性鑒定。

1.5.4 單克隆抗體的亞型鑒定

取建庫的雜交瘤細胞上清液，使用小鼠抗體亞型鑒定試劑盒對單克隆抗體的亞型進行鑒定，具體操作按照說明書執行。

1.5.5 單克隆抗體的B細胞表位鑒定

用Protein A/G PLUS-Agarose分別捕獲腹水中未純化的3株單克隆抗體，與10 μL噬菌體展示肽原始文庫共同孵育，洗滌3次后洗脫下特異性結合的噬菌體，測定噬菌體滴度，完成第一次淘選。擴增上一次淘選收集的噬菌體并濃縮至滴度≥1.5×1012pfu/mL，用于下一次淘選。第3次淘選后，從噬菌斑<100的滴度測定平板上各挑取30個單克隆進行間接ELISA鑒定。提取陽性噬菌體克隆的基因組，測序后翻譯出展示肽序列，比對分析得到同一株單克隆抗體結合肽的共有序列，與p54蛋白氨基酸序列進行同源性分析，確定單克隆抗體識別的抗原表位。詳細步驟參考Ph.D-12肽庫試劑盒說明書。

2 結果

2.1 重組質粒的構建與鑒定

p54蛋白膜內區基因(157～555 bp，53～183 aa)的PCR擴增產物長度與預期的399 bp相符(圖1A)。p54-pET-28a-DH5α重組菌的菌液PCR鑒定均為陽性(圖1B)。重組質粒pET-28a-p54經過雙酶切鑒定后獲得的片段與目的基因大小一致(圖1C)。基因測序結果顯示，重組質粒的插入序列與目的基因完全一致。

2.2 重組p54蛋白表達、純化及鑒定

SDS-PAGE結果顯示，重組菌株p54-pET-28a-BL21經IPTG誘導后大量表達分子量約為23 kDa的融合蛋白，與預期大小相符，重組蛋白部分為可溶性表達，部分為包涵體形式(圖2A)。通過His-tag鎳離子親和層析法純化的可溶性p54重組蛋白在電泳后染色呈單一條帶，純化效果良好(圖2B)。Western blot顯示His單克隆抗體和ASFV陽性血清標準品均能特異性識別p54重組蛋白，表明p54重組蛋白成功表達且具有良好的反應原性(圖3)。

2.3 單克隆抗體的制備

在小鼠第2次和第3次免疫后分別采集眼眶血，按本研究建立的ELISA方法測定小鼠血清抗體效價，結果顯示，免疫組小鼠的抗p54蛋白抗體效價均達到1∶51 200，可用于細胞融合。

按本研究建立的ELISA方法對成功融合的雜交瘤細胞進行篩選和亞克隆，最終獲得3株能穩定分泌抗p54蛋白單克隆抗體的細胞，分別命名為2A4、5F6和RH15。3株陽性雜交瘤細胞經過連續傳代培養20代次以上，培養基上清液中抗體效價仍維持在1∶12 800的較高水平，表明其分泌抗體能力穩定。

每株抗p54蛋白單克隆抗體的細胞約收集到10 mL腹水，按照本研究建立的ELISA方法測定腹水體水平，效價均達到1∶5 120 000。

2.4 單克隆抗體的反應性鑒定

Western blot結果表明，3株單克隆抗體能夠特異性地識別感染ASFV的PAM細胞(圖4A)，而不與PRRSV、CSFV、JEV感染細胞裂解物發生反應(圖4B)。

IFA表明，3株單克隆抗體能夠識別感染ASFV的PAM細胞，產生特異性的紅色熒光，熒光集中于ASFV感染細胞的病毒工廠區域。單克隆抗體不與陰性對照細胞發生反應(圖5)。

圖5 IFA鑒定p54蛋白單克隆抗體與ASFV的反應性

圖6 間接ELISA鑒定抗p54蛋白單克隆抗體與噬菌體克隆的結合

2.5 單克隆抗體的亞型鑒定

結果見表1，3株單克隆抗體的重鏈均屬于IgG1亞類，輕鏈均為Kappa型。

表1 p54蛋白單克隆抗體亞型鑒定

2.6 p54蛋白的抗原表位鑒定

2.6.1 液相淘洗的富集效果

經過4次淘洗，擴增后與擴增前的噬菌體滴度比值逐漸升高，回收率逐漸增大(表2)，說明與單克隆抗體特異性結合的噬菌體得到了選擇性富集。

表2 4輪篩選的噬菌體滴度和回收率

2.6.2 間接ELISA鑒定淘選

用間接ELISA鑒定第4次淘選得到的噬菌體。從第4次淘選產物滴度測定的LB/IPTG/X-gal平板中選擇噬菌斑<100個的平板，每種單克隆抗體隨機挑取出30個藍色噬菌斑進行擴增，用于間接ELISA鑒定。結果顯示，單克隆抗體2A4、5F6、RH15各有25、20、28個陽性噬菌體克隆(S/N≥2.1)，這表明，經過4次淘選，能與3株單克隆抗體特異性結合的噬菌體得到有效富集。

2.6.3 氨基酸多序列比對分析

提取間接ELISA為陽性的噬菌體核酸進行測序，使用Expasy-Translate在線工具分析得到噬菌體展示的12肽序列，之后用NCBI Protein BLAST工具進行同源性分析，發現單克隆抗體2A4、5F6的噬菌體12肽共有序列為NTASQ，單抗RH15的噬菌體12肽共有序列為RQRNTYTHKDL。將這2段多肽序列與ASFV內膜蛋白p54蛋白的氨基酸序列作進一步比對，結果顯示，單克隆抗體2A4、5F6篩選出的共有序列NTASQ與p54蛋白的157～161位氨基酸一致，單抗RH15篩選出的共有序列RQRNTYTHKDL則與p54蛋白的170～180位氨基酸一致，2段多肽序列與p54蛋白的一級結構有3個以上的連續氨基酸殘基重合，說明3株單抗識別的抗原表位均為線性表位。

3 討論

自2018年8月ASF在中國首次被報道以來，疫情迅速蔓延至全國，僅4個月已有21個省份受到波及，63.1萬頭生豬被撲殺。同時期，ASF在全球的流行也很活躍，包括俄羅斯、羅馬尼亞、波蘭在內的22個國家累計報告發生疫情5 800余起[7-8]。急性型ASF不僅致死率可高達100%，還具有極強的傳播能力，嚴重打擊了全球養豬業，引起豬肉市場價格的大幅波動。ASFV疫苗研制始于1960年，由于病毒具有遺傳多變性、結構復雜等特點，對單核-巨噬細胞之外的非靶細胞適應性差，易發生生物學特性的改變，另外宿主免疫保護和病毒免疫逃避機制也尚不明晰，因此疫苗的研發進程較為緩慢[9-11]。2022年6月，首個商品化ASFV疫苗NAVET-ASFVAC在越南上市，該疫苗是由高毒力的ASFV Georgia 2007/1株缺失I177L基因后制備的減毒活疫苗，經評估能在強毒株感染后給生長育肥豬提供有效的免疫保護，阻斷動物死亡并阻止經濟損失[12]。不過，接種NAVET-ASFVAC的豬群存在嚴重的排毒現象，不能排除毒力返強、變異和基因整合等風險，疫苗對母豬群的安全性評價并不明確，現今該疫苗的應用范圍僅局限于越南國內[12-13]。綜上，由于缺乏有效的治療藥物和安全的且能夠阻斷病毒感染的疫苗，ASF的防治和凈化策略仍側重于生物安全措施、提升豬群自身免疫力、全面監測與精準清除[14-15]。

單克隆抗體是由單一B細胞克隆所產生，能特異性識別單一抗原表位，被廣泛地應用于生物學基礎研究和臨床治療與診斷，如鑒定蛋白的表達與定位、靶向傳遞藥物、阻斷病原感染、富集和純化生物制品、檢測靶抗原等[16]。抗ASFV單克隆抗體的研制有助于加速解析病毒蛋白的結構與功能，探究病毒與宿主的相互作用和病毒的免疫逃避機制，從而更高效地篩選出抗病毒藥物，有針對性地開發疫苗，同時為建立高特異、高靈敏性的血清學診斷方法提供材料[17]。在以往研究中，結構蛋白p30、p54、p72被證明在ASFV感染過程中表現出強抗原性，且針對這3種蛋白的抗體具有一定的中和活性，能夠抑制病毒的黏附和內化[5]。遺憾的是，這3種蛋白并不足以引起完全的由抗體介導的體內中和作用，無法對不同毒株的感染產生有效的免疫保護，因此候選ASFV亞單位疫苗的應用局限性較大，僅僅能夠延緩臨床癥狀的出現時間和降低病毒血癥水平[18]。不過在ASFV血清學診斷方面，這些蛋白仍然是相當重要的靶標[19-20]。

本研究通過原核表達系統成功表達了ASFV p54重組蛋白，免疫小鼠后使用雜交瘤技術制備單克隆抗體，經過間接ELISA篩選和多次亞克隆獲得了3株能夠穩定分泌抗p54蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系。Western blot試驗顯示，3株單克隆抗體均能與ASFV感染的豬肺泡巨噬細胞發生特異性反應；IFA試驗也顯示，3株單克隆抗體能夠識別ASFV感染的豬肺泡巨噬細胞，證明這3株單抗具有良好的反應性，可用于靶抗原的特異性檢測。在IFA試驗中可以看到，與作為陽性對照的抗p30蛋白單克隆抗體分布在胞漿中的彌散性點狀熒光不同，本研究制備的3株單克隆抗體所識別的靶蛋白p54集中定位于靠近細胞核的病毒工廠中，呈致密的斑點狀熒光，這一表現與以往關于ASFV結構蛋白定位的研究相符[21-23]。亞型鑒定試驗顯示，3株單克隆抗體的重鏈均屬于IgG1亞類，輕鏈均為Kappa型，提示后續抗體純化如以腹水為來源材料時可能去除其中的自身免疫球蛋白(一般為IgG1和IgM)。通過噬菌體展示肽庫篩選，確定了抗p54蛋白單克隆抗體2A4、5F6識別的抗原表位為157NTASQ161，該表位與p54蛋白的動力蛋白輕鏈(DYNLL1/DLC8)結合域151TTVTTQNTASQT162存在部分重合[24-25]，后續將探究這2株單克隆抗體阻斷此結合位點的潛力，以期為研究ASFV與宿主蛋白的相互作用提供精準的生物學工具。單克隆抗體RH15識別的抗原表位經鑒定為170RQRNTYTHKDL180，該表位目前未被免疫表位數據庫(IEDB)收錄，也未見有相關文章報道，這一結果豐富了p54蛋白的B細胞線性抗原表位信息，可為進一步解析ASFV結構蛋白的功能結構域和更有針對性地設計亞單位疫苗提供參考。