基因編輯技術在豬遺傳育種中的研究進展

鄭虎，高美娟，楊化強

(華南農業大學動物科學學院，國家生豬種業工程技術研究中心，廣東 廣州 510642)

基因編輯技術利用人工核酸酶系統靶向切割生物體基因組特定位點，誘導細胞DNA損傷修復，產生定點突變，從而實現定向改變生物遺傳信息的目的。基因編輯技術與傳統的轉基因技術不同，轉基因技術是將目的基因隨機整合到基因組位點上使其表達，但是這種隨機插入造成了轉基因表達在不同轉基因個體之間的不一致性，影響了轉基因生物表型的穩定性；而基因編輯可以對目的基因位點進行定點突變，實現目的基因型和表型的預期改造。隨著基因編輯技術的進展，先后出現鋅指核酸酶系統(zinc finger nucleases，ZFN)，類轉錄激活樣受體因子核酸內切酶系統(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和規律性短回文重復序列簇系統(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas endonucleases，CRISPR/Cas)[1-4]等多種基因編輯工具。當前基因編輯已廣泛應用于生命科學、農業和醫學等領域，為生物醫學基礎和轉化研究、農業作物和動物遺傳改良帶來突破性進展。

在畜牧業領域，降低養殖成本、提高養殖生產效率是畜牧業發展的核心。畜禽遺傳資源是畜牧養殖可持續發展的源頭，動物遺傳育種繁殖新技術的變革和創新是促進優質種業發展的加速劑。隨著現代化生物育種技術(如動物轉基因技術、基因編輯、胚胎工程等遺傳育種和繁殖相關技術)的發展，家畜育種已經從傳統育種發展到以調整基因為主的現代分子育種技術。基因編輯技術在改良動物表型、加快遺傳進程上具有傳統育種技術無法比擬的優勢。在豬的遺傳育種上，基因編輯技術已成功應用于改善豬的生長性狀和生產性能、提升抗病性，促進了現代生豬種業的創新發展。同時，豬在生理學和遺傳學上與人類具有較高的相似性，利用基因編輯豬作為模型動物已廣泛應用于生物醫學領域的基礎和轉化研究[5-6]。本文聚焦于近年來基因編輯技術在豬育種領域的研究成果，綜述了基因編輯技術在豬遺傳育種改良中的研究和應用進展。

1 基因編輯技術及基因編輯工具

基因編輯通過使用特異性核酸酶識別特定基因序列，誘導基因組斷裂，利用基因組修復機制對斷裂基因組進行修復，實現目的基因位點的定向突變，從而改變生物體的特定性狀和功能。其本質是利用人工核酸酶靶向切割DNA雙鏈，使DNA靶位點發生雙鏈斷裂(double-strand-breaks，DSBs)，激活基因組非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)或同源定向修復(homologous-directed repair，HDR)機制，實現對目的基因的敲除或敲入[7]。其中NHEJ是真核生物DNA修復的主要方式[8]，其不需要相應的同源序列就能將DNA斷裂后的2個末端重新連接起來，這種修復一般是易錯的，導致DSB區域堿基缺失或額外堿基插入，引起目的基因發生移碼突變而達到基因敲除的目的[9]。HDR的修復方式以同源DNA作為修復模板，在DSB兩端的同源區域之間添加所需的修飾序列，實現基因敲入的效果。只有細胞內存在與損傷DNA同源序列時，才能激活HDR修復途徑。無論NHEJ還是HDR都依賴于DSB的產生，基因編輯工具通過誘導高效的定點DSB生成，從而實現高效的定點基因敲除或敲入。NHEJ修復的效率遠高于HDR，因此基因編輯介導的基因敲除效率遠高于基因敲入的效率。通過基因編輯工具產生DSB可引入一系列基因組編輯效果，從點突變到大片段定點插入，實現對目的基因的精確改造。

1.1 ZFNs

第一代基因編輯工具是利用限制性核酸內切酶在某些特定位置識別和切割DNA序列，隨著技術的不斷革新，ZFNs作為基因組定點編輯技術誕生。1996年，Kim等[10]將鋅指蛋白(zinc finger protein，ZFP，其中1個鋅指單元識別3個堿基)與FokⅠ(非特異性限制性核酸內切酶)融合，首次構建出具有靶向切割DNA功能的ZFN，其中DNA識別域由3～4個Cys2His2鋅指蛋白(Cys2His2ZFP)連接而成，用于特異性識別堿基三聯體[11]；DNA結構域C端為FokⅠ切割結構域，該結構域二聚形成非特異性核酸酶才具有切割基因組活性[12]，同時有利于減少對DNA的非特異性剪切。當2個ZFN分別與靶位點結合時，FokⅠ亞基單體結合發生二聚形成功能性核酸酶作用產生靶向DSB，并誘導DSB修復通路[10]。ZFN的特異性取決于ZFP，單個ZFP的特異性取決于周圍鋅指所在的環境和目標DNA，并不是所有的DNA三聯都有相應的鋅指結構域可用；ZFP與FokⅠ在靶序列上的連接方式和位置同樣會影響ZFN的結構活性和功能特異性[13]。ZFN靶向技術的最新進展可以改進鋅指單元之間跳過核苷酸的能力，Paschon等[14]對ZFN結構蛋白進行改造，通過改變DNA結合域和ZFN結構域的順序，利用新的接頭跳過鋅指單元之間的核苷酸序列，即如果相鄰的3 bp并沒有合適的一個單元，則可以跳過1 bp，大大增加了ZFP與目標序列匹配的幾率，提高ZFN的靶向精確度。

然而，ZFP載體構建較為復雜，與配體結合力較弱，ZFN剪切的過程容易形成異源二聚體，誘導脫靶效應；同時引起堿基錯配和DNA序列改變，產生一定的細胞毒性，導致細胞發生死亡、額外突變[15]。此外，ZFN在識別DNA位點時，存在著上下文依賴效應，即識別DNA的重復氨基酸時會產生相互作用，改變特異性識別，影響基因編輯的效果。

1.2 TALENs

TALENs是利用變形菌屬植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)分泌的天然蛋白——激活因子樣效應物(TAL effectors，TALEs)，通過人工添加一個在特定位點切斷DNA雙鏈的核酸酶，形成的具有DNA特異性識別和切割功能的蛋白質工具。該技術最初由Christian等[16]建立。TALENs由一個N端結構域——核定位信號(nuclear localization signal，NLS)，一個DNA識別域——特異性識別基因組靶序列，以及一個FokⅠ內切酶的C端結構域組成。其中DNA識別域由保守的氨基酸重復序列單元組成，每個單元又由14～18個識別DNA特異序列的TALE單元連接而成[17-18]，每個TALE蛋白通過DNA識別域識別一個對應的堿基從而結合到靶位點上；FokⅠ DNA切割結構域與TALE融合形成二聚體TALENs，特異性切割靶序列，其切割DNA的原理與ZFN相似。TALENs的序列單元通過組裝成模塊化蛋白質，用于特異性結合與靶向內源性目的基因，解決ZFNs不能任意識別目的基因序列和識別序列存在著上下文依賴效應等問題。

與ZFNs技術相比，TALENs與DNA靶位點結合具有高度特異性，識別DNA序列較長，同源序列較少，極大地降低了脫靶率；而且TALENs相較于ZFNs，其識別性更為廣泛、靈活性更強、切割效率和成功率高，細胞毒性小。但是，TALENs構建比較困難，需要大量的試驗步驟和技術，技術門檻較高。此外，雖然相對于ZFNs已經有了顯著的改進，TALENs仍然存在著一定的脫靶和細胞毒性問題，還需要進一步提高精確性和安全性。

1.3 CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9普遍存在于古細菌和細菌體內，是一種菌體特異性免疫系統，該系統首次由Ishino等[19]在大腸桿菌堿性磷酸酶基因中發現，之后通過對其他細菌的基因結構進行研究，Mojica等[20]和Jasen等[21]也發現該系統的存在，并提出用CRISPR來命名該結構。在大多數細菌及古細菌中，該結構是由一段保守的重復序列區(repeat)和一段間隔序列區(spacer)組成的重復性DNA序列，其中spacer區用于細菌捕獲的外源基因片段。2005年，Pourcel等[22]揭示了CRISPR的內部結構，指出CRISPR系統中的spacer區具有與宿主菌胞質同源的遺傳物質，由此認為細菌可利用CRISPR進行體內干擾從而抵抗外源基因的入侵。2007年，Barrango等[23]研究表明宿主菌可以進一步運用CRISPR系統干擾噬菌體入侵菌體。研究發現，Cas基因可以編碼多種功能的Cas蛋白，與CRISPR序列區域共同組成CRISPR/Cas系統發生作用，進而特異性識別外源性遺傳物質的靶序列，Cas蛋白可以與CRISPR啟動子前導區(leader)轉錄生成的CRISPR-RNAs(crRNA)相結合，靶向切割外源性DNA序列，對抗病毒對細菌體的入侵[24]。隨后，反式激活crRNA(transactivating crRNA，tracrRNA)與crRNA前體相結合形成向導RNA(single-strand RNA，sgRNA)，并與Cas核酸酶作用形成復合體，特異性識別并剪斷特定核苷酸序列[25]。2008年，Marraffini等[26]研究表明CRISPR/Cas系統能有效阻止外源基因在體內的合成和表達，隨后研究者揭示CRISPR/Cas系統是微生物體內一種可穩定遺傳的適應性免疫系統，能將病毒的遺傳序列轉化為自身序列，保護自身進行二次免疫。

由于不同的CRISPR/Cas系統在適應階段具有高度保守性，且其在表達、干擾階段有所差異，故將其分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，適用于基因編輯最常用和最具特征的CRISPR/Cas系統是基于化膿鏈球菌發展而來的Ⅱ型基因編輯工具——CRISPR/Cas9系統。2012年，Jinek等[27]首次發現CRISPR/Cas9可以通過sgRNA作為單一轉錄本進行編程用于體外靶向DNA切割。根據CRISPR/Cas9系統基因編輯的原理，Cas9系統主要包括Cas9蛋白——核酸內切酶活性、crRNA——靶向特異性和tracrRNA，其中crRNA和tracrRNA結合形成一條sgRNA，sgRNA與原間隔區相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)序列(NGG)毗鄰的靶DNA互補，由一段識別序列(20 bp)和一段重復序列組成，其中識別序列利用堿基互補原則靶向結合到基因位點上，Cas蛋白與重復序列形成復合體結構用以發揮核酸酶內切功能，靶向切斷雙鏈核苷酸目的序列[1]]，形成DSB，雙鏈DNA斷裂后利用NHEJ和HDR兩種方式進行細胞自我修復，從而對靶點堿基進行隨機插入或刪除，使基因產生移碼突變或破壞基因組結構，導致基因組功能失效或基因敲除[9]。2013年，Cong等[28]首次利用CRISPR/Cas9在人293T細胞與小鼠Nero2A細胞進行靶向基因定點突變，CRISPR/Cas9系統作為基因編輯新技術的應用，推動了基因編輯的不斷更新。隨著CRISPR/Cas9系統研究不斷深入，科學家將多個sgRNA表達框構建到相應靶點序列，然后將其整合在同一個載體中，從而實現sgRNA表達框的共同表達，其高切割活性允許在單個反應中同時靶向單個細胞中的多個DNA序列位點，從而敲除多個基因或染色體長片段，實現更靈活和多樣化的基因修飾效果。

CRISPR/Cas9系統相較于ZFN和TALEN，具有打靶特異性、高精度性和操作簡單等優點，僅需sgRNA引導即可對基因組任意位點進行打靶，切割能力不受基因組甲基化影響[29]，編輯效率高、成本低，在動植物基因編輯中得到了廣泛的利用，大大降低了基因編輯的門檻。但是，CRISPR/Cas9在應用上依賴PAM序列，依然存在脫靶效應和大片段插入效率低等問題。表1對目前基因編輯系統的特點進行了相關比較(表1)。

表1 ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系統的比較

2 基因編輯在豬育種中的應用

基因編輯通過引入新的遺傳變異(如遺傳缺陷的修復、無關基因的滅活、有用的等位基因和單倍型在品種間的表達等)來加速畜禽遺傳改良，利用基因編輯技術對經濟性狀相關基因進行編輯(敲除、插入或修飾)，增加群體中有利等位基因的頻率來提高群體遺傳效益，促進畜禽生產。在豬的育種工作中，種系傳播是最終目標，編輯后的目標基因必須穩定傳遞給下一代，以進行群體或種系遺傳改良。常用的基因編輯育種策略主要利用體細胞核移植技術(somatic cell nuclear transfer technique，SCNT)將編輯好的細胞系進行克隆，在一代內即可產生基因純合修飾的基因編輯豬，但是該方案也存在核移植效率低以及基因編輯克隆后代出生率低的缺陷；另一種制備基因編輯豬的策略是直接對豬單細胞胚胎進行CRISPR注射，該方案操作較為簡便，同時也可避免基因編輯克隆豬制備效率低的問題，但是該種方案出生的后代一般都為嵌合體動物，需要繼續雜交1～2代以獲得純合基因編輯動物。基因編輯現階段已應用于下述多個性狀的種豬遺傳育種改良。

2.1 提高生產性能

豬肉是最主要的肉類食物來源，改良豬肉相關經濟性狀是豬育種工作的重點之一。肌肉的發育和體重的增長通過垂體和肝臟系統進行調節，主要由生長激素(growth hormone，GH)-胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)軸通過IGF-1R/Akt/mTOR信號通路進行調控[30]。1985年，Hammer等[31]將人源性GH通過胞質注射導入母豬受精卵內獲得轉基因豬，與野生型豬相比，GH轉基因顯著提高了豬的生長速度。另有研究將豬源性的GH轉入湖北白豬體內獲得的轉基因豬，與野生型豬相比，其生物轉化率提高10%左右。GH由腦垂體釋放，刺激肌肉、肝臟等組織中的IGF-1表達，研究表明來自肌肉和肝臟中IGF-1均能刺激肌肉發育。Pursel等[32]通過向受精卵中注射DNA，成功地將編碼GH和IGF-1的基因引入豬體內，其中表達GH轉基因的2個家系比野生型豬的體重增加了11.1%和13.7%，飼料轉化效率均提高了18%左右，皮下脂肪水平降低，肌肉、皮膚和骨骼發育速度增加。表達IGF-1的轉基因豬其生長速度雖與野生型豬類似，但脂肪含量顯著減少，瘦肉組織顯著增加。雖然在生長性能上有了明顯改善，但也發現GH轉基因豬存在跛行、嗜睡和胃潰瘍增加等生理缺陷，對壓力的有效反應能力降低等問題。IGF-2是IGF-1的姐妹分子，也在肌肉發育和脂肪沉積中起關鍵作用，IGF-2基因調節區的突變調控豬肌肉生長水平。1999年，Jeon等[33]發現豬IGF-2第3個內含子處的核苷酸突變使得IGF-2在骨骼肌發育過程中的表達顯著增加，有效提高瘦肉率。2018年，Xiang等[34]運用CRISPR/Cas9系統對IGF-2基因第3個內含子上的單核苷酸位點(第3 072位核苷酸)進行突變，培育出IGF-2基因修飾巴馬豬，與野生型豬相比，其產肉量和瘦肉率都顯著增加。2019年，Liu等[35]運用CRISPR/Cas9系統對豬胎兒成纖維細胞(porcine fetal fibroblasts，PFFs)進行編輯，破壞與ZBED6結合的IGF-2第3個內含子序列位點，從而消除了ZBED6阻遏物的結合，使其調節功能喪失，培育出具有較高瘦肉率的IGF2基因編輯豬。

肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)是個體生長、肌肉發育和脂肪沉積研究的常見靶點，對肌肉生長起負調控作用，其突變會誘導肌肉發育或產生“雙肌”性狀。MSTN基因由3個外顯子和2個內含子組成，其中第3個外顯子決定了MSTN成熟肽的作用，可以通過破壞第3個外顯子的結構使MSTN生物活性喪失。2015年，Qian等[36]利用ZFN技術培育出MSTN基因突變的梅山豬，與野生型豬相比，MSTN突變體生長發育正常，肌肉質量增加，脂肪沉積減少，純合MSTN突變體(MSTN-/-)具有明顯的“雙肌”表型。吳添文等[37]使用TALEN技術對MSTN基因進行編輯并培育出MSTN基因突變大白豬、梅山豬。華文君等[38]利用CRISPR/Cas9編輯MSTN位點，并結合SCNT技術獲得高產瘦肉基因編輯豬新種質——中超916。2016年Bi等[39]利用CRISPR/Cas9系統和Cre/LoxP重組酶系統產生無選擇性標記基因的MSTN基因單敲除克隆豬，其中MSTN表達量下降50%，肌源性基因表達顯著上升，提高了肌纖維數量，增加了豬體瘦肉率。2017年，Wang等[40]運用CRISPR/Cas9系統編輯PFF細胞中MSTN基因，并運用SCNT技術成功培育出MSTN雙等位基因突變克隆豬，與野生型豬相比，基因編輯豬肌纖維數目增加，出現明顯的肌間溝，豬體瘦肉率得到顯著提高。2020年，Li等[41]使用CRISPR/Cas9將PVD20H和GP19del突變基因導入中國本土豬種的MSTN信號肽區，發現信號肽中的2個突變都增加了肌肉質量，這種策略可以上調肌源性調節因子(MyoD、Myogenin和Myf-5)的表達，且不影響細胞中MSTN成熟肽的產生。該研究表明通過對MSTN信號肽進行精確編輯也可以提升豬肌肉的發育。然而，有報道指出，MSTN敲除豬雖然有效改善了產肉量和瘦肉率，但同時出現一系列動物健康問題，如MSTN純合基因敲除豬存在腿部發育異常、無法站立和行走以及高死亡率的問題。Kang等[42]報道了MSTN基因敲除豬具有肌肉發達、瘦肉增加和背膘減少的優點，但在長白品種的MSTN純合敲除仔豬中存在前腿或后腿異常、無法站立和行走的問題，受影響的小豬無法競爭哺乳，并在出生后3 d內死亡。

SCF E3泛素連接酶在許多細胞基礎活動過程中發揮重要作用，其由SKP1、Cullin-1/Cdc53和一種Fbox蛋白組成，Fbox蛋白賦予復合物底物特異性，其中Fbxo40誘導胰島素受體底物-1(IRS1)泛素化，從而使IGF-1/Akt通路失活[43]。Fbxo40表現出肌肉特異性表達模式[44]，在Fbxo40基因敲除小鼠中，IGF-1/Akt途徑激活，體重和肌肉質量顯著增加。2018年，Zou等[45]利用CRISPR/Cas9技術和SCNT制備了Fbxo40基因敲除豬。在Fbxo40基因敲除豬的肌肉中，IRS1水平提高，IGF-1/Akt通路激活。與野生型對照相比，Fbxo40敲除豬的肌肉質量增加了約4%，瘦肉率也得到提升，且Fbxo40基因敲除豬沒有任何異常表型。因此，Fbxo40可作為未來規避MSTN突變副作用的可能替代基因操作位點，然而這一觀點尚未被充分證實，需要進一步的研究來驗證其可行性和安全性。Fbxo40和MSTN基因敲除動物之間的差異可能是由于基因時空表達或調節的差異所致，Fbxo40主要在出生后的動物骨骼肌中表達[44]，而MSTN在胚胎發育到成年期都有表達，其通過自分泌或旁分泌系統調節肌肉細胞原始細胞[46]。因此，MSTN可能更廣泛地影響包括肌肉在內的多種器官發育，而Fbxo40的功能僅限于骨骼肌。表2匯總了目前已報道的采用基因編輯策略提升豬生產性能的研究(表2)。

表2 基因編輯技術在提高豬生產性能上的應用

2.2 改善豬肉品質

當前養豬業除了提高豬肉的產量，對豬肉品質的要求也不斷提高。不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids，UFAs)具有調節血脂、預防血栓、調節免疫等生物學效用，有較高的營養價值。哺乳動物自身不能合成或合成的量不能滿足機體生長發育所需，需通過采食來攝取體內所需的UFAs。2004年，Saeki等[47]在豬的基因組中導入菠菜根部脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase-2，FAD-2)基因，獲得了高不飽和脂肪酸(highly unsaturated fatty acid，HUFA)轉基因豬，其不飽和脂肪酸的含量比野生型豬高20%。多不飽和脂肪酸(ploy unsaturated fatty acids，PUFAs)分為ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸兩大類，ω-6脂肪酸促進炎癥的發生，而ω-3脂肪酸卻能延緩身體自我防衛機制中那些不利方面的過度反應，抑制炎癥的發生，可有效改善心腦血管疾病。由于豬的體內缺乏相應脂肪酸轉化酶，ω-6脂肪酸不能自主轉化為ω-3脂肪酸[48]。秀麗隱桿線蟲體內含有一種編碼脂肪酸去飽和酶的基因(Fat-1)，可以將ω-6多不飽和脂肪酸(ω-6 PUFAs)轉化為ω-3多不飽和脂酸(ω-3 PUFAs)。2006年，Lai等[49]將Fat-1基因引入豬的基因組中，生產出富含ω-3 PUFAs的轉基因豬，豬肉的營養價值得到顯著提高。2012年，Zhang等[50]將編碼子優化的mFat-1基因插入真核表達載體中，生產表達mFat-1基因的轉基因豬。2018年，Li等[51]通過CRISPR/Cas9技術將Fat-1基因成功插入豬Rosa26(pRosa26)基因座上，培育出定點修飾的Fat-1轉基因豬。然而，由于這些轉基因豬缺乏Δ-12去飽和酶(Fat-2)基因，只將外源性而非內源性產生的ω-6 PUFAs轉化為ω-3 PUFAs。2019年，Tang等[52]利用SCNT技術成功培育出脂肪酸去飽和酶Fat1-Fat2共表達的轉基因豬，使肌間脂肪組織中ω-3和ω-6的含量得到顯著提高。2021年，You等[53]通過使用CRISPR/Cas9系統和SCNT技術，將Fat-1和IGF-1基因精確插入pRosa26基因座上，獲得定點修飾的雙基因轉基因豬，其中ω-3 PUFAs水平顯著增加，并降低ω-6/ω-3 PUFAs比率，提供了富含ω-3 PUFAs的肉類。生產中在提高豬肉ω-3 PUFAs含量的同時，人體也應該合理控制對ω-3 PUFAs的攝入量，不宜過量，因為ω-3 PUFAs攝入過量會延長人體凝血時間，增加出血風險，同時引起機體氧化應激，導致細胞損傷和炎癥反應，抑制免疫系統，增加疾病感染風險等不良影響。

豬牛羊等肌肉細胞表面存在α-半乳糖苷抗原(galactose-α-1，3-galactose，α-gal)，食用紅肉(豬肉、牛肉和羊肉)可能會在部分人群誘發過敏[54]。同時紅肉細胞表面存在大量的N-甘氨酰神經氨酸(Neu5Gc)[55]，一旦被機體吸收，就會結合在人類細胞表面，引發慢性炎癥，從而導致結、直腸癌和動脈粥樣硬化。這些罕見的綜合征可以通過基因編輯培育基因敲除動物去除肌肉表面的過敏抗原來避免。CMPN-甘氨酰神經氨酸羥化酶(CMAH)基因敲除可以將豬中的Neu5Gc轉化為人源性Neu5Ac，消除Neu5Gc的副作用。Yen等[56]通過將CRISPR/Cas9制備的α-Gal敲除和Neu5Gc敲除豬進行雜交獲得雙基因敲除后代，發現雙基因敲除型豬比野生型豬誘發的炎癥更少，減少紅肉過敏現象，將其作為健康的紅肉來源。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子α(peroxisome proliferator-activated receptor gammaco-activator 1 alpha，PGC1α)是一種調控肌纖維類型轉化和線粒體生物合成的轉錄共激活因子。2017年，Zhang等[57]和Ying等[58]通過過表達豬肌肉中PGC1α基因，顯著增加了肌肉線粒體的生物發生，通過增強線粒體呼吸和脂肪酸氧化，將快速糖酵解纖維轉化為緩慢和氧化纖維，改善肉色，降低滴水損失，有效提高豬肉品質。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)是脂肪形成的主要調節因子，在骨骼肌纖維形成和脂肪沉積中起重要作用，2021年，Gu等[59]制備了肌肉特異性過表達PPARγ的轉基因豬，PPARγ可通過激活脂肪細胞分化調節因子的增強表達來促進脂肪細胞分化，從而進行脂肪沉積，顯著增加PPARγ轉基因豬肌肉內脂肪含量。特異性PPARγ的過表達也可以促進氧化纖維的形成，同時保持了胴體瘦肉率。表3對目前已報道的基因編輯改善豬肉品質的研究做出相關匯總(表3)。

表3 基因編輯技術在改善豬肉品質上的應用

2.3 改善仔豬抗寒性

解偶連蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)位于線粒體內膜，通過解偶聯ATP合成和質子穿過內膜產生熱量。UCP1是非寒顫產熱的關鍵因子，負責棕色脂肪組織(BAT)介導的產熱，在提高仔豬有效抗寒和調節體溫平衡方面起關鍵作用，UCP1還參與動物脂肪沉積，調節身體肥胖方面發揮重要作用。豬線粒體中的UCP1表達非常低甚至不存在，引起BAT功能表達較弱，機體產熱性能下降，加速脂肪沉積，盡管Lin等[60]證明了豬的冷適應依賴于BAT細胞中的UCP3，但由于仔豬出生后體溫調節系統發育不良，機體缺乏非寒顫產熱，仔豬表現出較差的熱調節。2017年，Zheng等[61]通過外源性小鼠UCP1的cDNA構建了豬脂聯素啟動子，并使用CRISPR/Cas9技術將其定點插入到豬內源性UCP1基因外顯子的第2位點位上，成功制備出能夠抗寒的轉UCP1基因豬。試驗發現，在4 ℃寒冷條件下，野生型仔豬體內直腸溫度在急性冷暴露環境下的前2 h表現出體溫持續下降，在第3和第4小時略有恢復，但仍顯著低于UCP1轉基因仔豬的直腸溫度，而UCP1轉基因仔豬體內直腸溫度可以保持38 ℃的正常體溫4 h，且比野生型仔豬體溫高2 ℃。由于脂聯素啟動子驅動脂肪細胞UCP1的表達，與野生型仔豬相比，轉UCP1基因豬生長正常，背膘厚度、脂肪細胞大小和體脂沉積均顯著減少，胴體瘦肉率得到顯著提高。

2.4 提高抗病性

當今養豬業高密度的飼養模式加速了豬傳染性疾病的發生和傳播，這些傳染性疾病造成生豬養殖死亡率上升、生產效率下降，極大地降低了養豬業經濟效益?；蚓庉嫾夹g的新突破從遺傳本質上賦予動物對病原感染的抗性，為預防和控制養殖業傳染性疫病提供了新的思路。近年來，基因編輯技術在豬抗病育種研究中取得諸多進展，如利用全基因組學鑒別致病毒力基因、誘導基因靶向缺失或突變制備弱毒或減毒疫苗、進行動物抗病育種改良等。

2.4.1 豬繁殖與呼吸綜合征

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，即豬藍耳病，可引起妊娠后期母豬流產，感染仔豬呼吸系統，引起呼吸系統傳染病甚至死亡。PRRS的病原是豬繁殖和呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，具有高度傳染性，同時由于PRRSV的高進化率，PRRSV分離株顯示出高度的遺傳和抗原變異性，阻礙了疫苗免疫的有效性。PRRSV感染宿主細胞主要通過受體介導的途徑，PPRSV在宿主體內表現出精準的細胞嗜性，靶向豬單核細胞或巨噬細胞的特定亞群，并通過硫酸乙酰肝素(heparan sulphate，HS)，唾液黏附素(sialoadhesin，Sn)和清道夫受體CD163(cluster of differentiation 163)等多個受體感染宿主細胞[62]。

2016年，Whitworth等[63]敲除豬受體基因CD163后對其進行攻毒，發現CD163基因敲除豬對PRRSV感染具有完全抗性，證實CD163是PRRSV入侵宿主時的關鍵受體。CD163第7個外顯子上富含與病毒互作位點——半胱氨酸結構域5(scavenger receptor cysteine-rich domain 5，SRCR5)。目前，通過基因編輯技術對CD163的敲除、CD163基因第7個外顯子SRCR5的缺失和病毒感染袋中第7個外顯子的部分缺失已經實現了對PRRSV感染的抗性提升。2017年，Burkard等[64]通過胚胎注射CRISPR/Cas9消除CD163的第7外顯子，成功制備了CD163基因外顯子7缺失的基因編輯豬，攻毒試驗顯示基因編輯豬對PRRSV-1和PRRSV-2感染具有抵抗力。2019年，Guo等[65]利用CRISPR/Cas9技術精確地敲除了兩廣小花豬和大白豬品種中CD163 SRCR5結構域中一段長度為41個氨基酸片段，通過病毒感染試驗發現這些基因編輯豬對PRRSV-2具有抗性。2020年，Xu等[66]使用CRISPR/Cas9和SCNT成功地產生了CD163和pAPN(豬氨肽酶N，一種導致傳染性胃腸炎病毒TGEV感染的因子)雙基因敲除(double knock-out，DKO)的基因編輯大白豬，通過攻毒試驗發現這些DKO豬對PRRSV-2和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)表現出完全抗性，且與野生型豬相比，其生產性能和繁殖性能沒有顯著差異。2021年，Tanihara等[67]通過電穿孔將靶向CD163基因第7外顯子的CRISPR/Cas9系統引入豬體外受精的受精卵中，也制備了對PRRSV具有抗性的基因編輯豬。

2.4.2 非洲豬瘟

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是一種傳播速度快、致病性和死亡率高的傳染病，其發病過程短，可引起豬發生急性出血熱，給全球養豬業帶來巨大損失。ASF是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起，ASFV的基因組龐大且復雜，DNA大小在170 kb至190 kb，可編碼150多個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其中包含50種結構蛋白和100種宿主誘導的免疫調節蛋白[68]。豬巨噬細胞是ASFV攻擊的天然靶細胞，抗CD163基因的抗體能夠抑制ASFV對宿主細胞的攻擊，減弱ASFV與巨噬細胞的結合，推測其可以作為ASFV侵染宿主的潛在受體，然而，Popescu等[69]用ASFV攻擊CD163 KO豬，發現CD163基因編輯豬不能抵抗ASFV的感染，在CD163 KO和野生型豬之間觀察到臨床癥狀和毒理學幾乎沒有差異。由于疣豬和家豬感染ASFV后癥狀有顯著差異，Palgrave等[70]對二者進行比較分析發現疣豬和家豬之間RELA(NF-κB轉錄因子P65亞基)基因存在序列差異，推測RELA基因的多態性可能賦予豬對ASFV感染的不同敏感性，并有后者通過TALEN和ZFN制備了RELA點突變的基因編輯豬[71]。然而，通過替換3個氨基酸引起的RELA突變并沒有使家豬對ASFV產生明顯抗性，它只是延遲了臨床癥狀的發作，并導致一些動物鼻分泌物和血液中的病毒減少[72]。Hübner等[73]用編碼Cas9的質粒和靶向ASFV CP204L的sgRNA轉染豬細胞，證明該CRISPR系統能在細胞水平抑制ASFV的感染，Cas9切割病毒基因組使病毒產量降低了4個數量級。

2.4.3 偽狂犬病

偽狂犬病(pseudorabies，PR)是一種強急性自然疫源傳染病，病原是偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)，也稱(suid herpesvirus-1，SuHV-1)。豬是PRV的天然宿主和傳染源，在病豬中表現為消化道、呼吸道和神經性疾病，其中仔豬極易患病，表現為高熱、腹瀉嘔吐和神經系統癥狀，具有較高死亡率，妊娠母豬感染后出現流產、死胎等繁殖性障礙，嚴重危害全球養豬業發展。

目前已有多項利用基因編輯技術修飾宿主基因進行PRV抗病育種的研究。PRV對宿主細胞的感染可以由細胞膜蛋白Nectin1和Nectin2(PRV病毒糖蛋白gD候選受體)介導，2020年，Huang等[74]利用CRISPR/Cas9靶向PK15細胞中敲除Nectin1和Nectin2基因，與野生型(WT)細胞相比，Nectin1或Nectin2基因敲除細胞中的PRV載量顯著減少。通過同時敲除PK15細胞中的Nectin1和Nectin2，發現與單基因敲除細胞相比，雙基因敲除細胞對PRV的抵抗力沒有進一步增加，進一步研究發現，Nectin1或Nectin2 KO不會顯著影響病毒對細胞的吸附和內化，但會阻斷PRV在細胞間傳播。因此Nectin1和Nectin2可能是有效的PRV抗病育種候選基因位點。先前的研究報道，Nectin1的胞外N-末端可變區樣(V)結構域對α皰疹病毒感染很重要，某些殘基中的氨基酸取代會嚴重降低PRV gD/Nectin1結合和PRV感染能力[75]。2022年，Yang等[76]將Nectin1的129位處的苯丙氨酸突變為丙氨酸產生Nectin1(F129A)點突變小鼠，用PRV感染突變小鼠發現，純合突變小鼠顯著減輕了疾病表型，降低了血清與腦組織中的病毒載量和小鼠死亡率。Nectin1基因修飾是賦予動物PRV抗性的有效途徑，為培育PRV抗病豬提供方法參考。CRISPR/Cas9可直接剪切PRV基因組來清除胞內病毒，從而有效防治PRV感染。2017年，Tang等[77]利用CRISPR/Cas9系統靶向PRV基因組中的多個基因位點(多為病毒基因組UL和Us區)，設計了75組sgRNA，通過熒光素酶(Luciferase)標記PRV進行sgRNA高通量篩選，發現大多數sgRNA顯著抑制PRV復制，使用多個sgRNA同時靶向PRV可完全抑制細胞中PRV的復制。2018年，Ren等[78]構建了靶向PRV UL30的CRISPR系統，發現其可以在細胞水平顯著抑制PRV的感染。H?lper等[79]建立了豬sgRNA文庫，靶向豬基因組中所有注釋基因，并使用該文庫篩選PRV感染豬細胞的關鍵宿主基因。該研究鑒定出鞘磷脂合酶1(sphingomyelin synthase 1，SMS1)在PRV感染中發揮重要作用。表4對當前基因編輯在提高豬只抗病性方面的應用進行了相關概括(表4)。

表4 基因編輯在提高豬只抗病性上的應用

3 小結和展望

基因編輯技術可快速實現豬的生產性能、抗逆性和抗病性等方面的改良，對養豬業的創新發展具有重要意義。雖然當前基因編輯在技術操作上并無顯著瓶頸，但該技術在應用中仍存在一定的脫靶效應、額外DNA插入等問題，基因編輯豬的生物安全具有一定風險性。農業農村部對農業用基因編輯產品其脫靶性、載體片段隨機的整合和載體序列殘留等具有一定要求，且要求編輯后的基因在個體間無基因漂移的發生，這就需要提高基因編輯對目的基因定點修飾的效率、降低脫靶效應，建立更加優良的基因編輯系統，培育符合生物安全規范的基因編輯豬。

盡管基因編輯豬在實驗室中顯示出潛在優勢，但其能否用于商業化生產還存在一定的生物安全性和產業轉化應用問題，亟待我們進一步研究和解決。農業部要求農業用基因編輯產品的生物安全需滿足食用安全和環境安全，即不會對人類健康或環境造成危害，因此，基因編輯豬的食品安全需要經過嚴格的實驗室試驗驗證，對基因編輯豬自身健康狀況、行為表現、生長和繁殖能力以及豬肉的營養價值、毒性和過敏原性等方面進行安全性評估，使優良經濟性狀的基因編輯豬肉滿足人體食用標準，同時對基因編輯豬進行嚴格的環境風險評估，以確保不會對環境造成負面影響。此外，基因編輯豬能否用于商業化生產，除了基于基因編輯豬對人類、自身和環境是否有益外，還取決于社會公眾的可接受性，當前人們對基因編輯的倫理問題還具有爭議，在基因編輯全面到來以前，人們仍需保持警惕、審慎、包容和創新的態度接受該技術的應用。因此，建立合理的基因編輯產品管理體系、強化監管和審批流程，進行公眾教育，以提高公眾對基因編輯技術的認識和理解，推進基因編輯動物從實驗室走向市場。