藜麥抗壞血酸過氧化物酶基因（CqAPX）家族生物信息學(xué)與表達(dá)模式分析

摘要：為研究藜麥APX（CqAPX）基因結(jié)構(gòu)和功能，本研究利用生物信息學(xué)方法和公共數(shù)據(jù)庫對CqAPX基因家族成員的理化性質(zhì)、保守基序、基因結(jié)構(gòu)和順式元件以及表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明，CqAPX具有較高的進(jìn)化保守性，可劃分為4個類群。此外，CqAPX基因的啟動子含有豐富的與脅迫相關(guān)的順式作用元件，藜麥 APX基因在根、葉、花絮和種子中組織特異性表達(dá)。干旱、鹽和熱脅迫處理能夠顯著改變CqAPX基因的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：藜麥；抗壞血酸過氧化物酶；非生物脅迫；基因家族

中圖分類號：Q751 " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

植物生長發(fā)育過程中存在有諸如熱、冷、鹽、旱等大量的環(huán)境脅迫，脅迫應(yīng)激產(chǎn)生的ROS在調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的信號方面具有重要的功能，然而過多的ROS產(chǎn)生導(dǎo)致核酸、脂類和蛋白質(zhì)的非功能修飾，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能的缺陷，最終導(dǎo)致植物死亡[1]。因此，ROS的產(chǎn)生和清除之間的平衡對正常細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)顯得尤為重要[2]。植物為抵御體內(nèi)ROS過多對自身造成的傷害，逐漸進(jìn)化出抗氧化系統(tǒng)，主要以酶促抗氧化機(jī)制為主，其中酶促反應(yīng)主要包括抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶[3]。其中，APX廣泛存在于綠藻、紅藻和高等植物中，以抗壞血酸作為特定的電子供體，催化H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2[4-6]。目前為止，APX基因已經(jīng)在多個物種中進(jìn)行了成員鑒定，如擬南芥、水稻、玉米、番茄、大豆等[7-9]。但是目前為止還沒有CqAPX基因相關(guān)文獻(xiàn)的報道。

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.），是莧科一年生雙子葉草本作物能夠適應(yīng)廣泛的農(nóng)業(yè)生態(tài)條件，包括土壤鹽分、干旱和寒冷[10]。藜麥?zhǔn)且环N鹽生植物，它具有較高的耐鹽性，可以在NaCl濃度近似海水的土壤中生長。藜麥含有多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、多酚、植物固醇和類黃酮等[10]。藜麥由于其營養(yǎng)價值和對邊際化土壤的適應(yīng)能力，已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織宣布為全球糧食可持續(xù)發(fā)展的重要作物。

1材料與方法 。

1.1 基因家族成員鑒定

TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）獲得擬南芥APX基因家族成員的蛋白序列，Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）數(shù)據(jù)庫獲得藜麥基因組序列文件和基因結(jié)構(gòu)注釋文件，構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫，將擬南芥的APX蛋白序列用作BlastP的查詢序列（E-valuelt;1×10-5），通過TBtools軟件獲取CqAPX基因家族候選成員，并從Pfam（http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫獲取包含有APX保守結(jié)構(gòu)域的HMM模型（PF00141），然后再將結(jié)合兩個結(jié)果將整理所得的候選CqAPX蛋白序列提交至NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)校對，剔除不包含保守結(jié)構(gòu)的冗余序列和假基因，得到19個CqAPX基因家族成員。

1.2基因家族染色體定位和蛋白理化性質(zhì)

使用ProtParam服務(wù)器（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測CqAPX蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)和計算氨基酸數(shù)目、等電點、分子量、不穩(wěn)定系數(shù)等。從藜麥的基因組注釋文件中提取CqAPX基因家族成員在染色體起始位置信息。WOLF PSORT （https ：//www.gensc ript.com/wolf-psort .html）對CqAPX蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位進(jìn)行預(yù)測。

1.3基因共線性分析

從數(shù)據(jù)庫Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/），下載C.quinoa、C.suecicum和C.pallidicaule的基因組。在此基礎(chǔ)上，使用多個共線掃描工具包MCScanX分析CqAPX基因家族成員之間以及與兩個祖先基因的共線性區(qū)域?；谝陨闲畔⒗肨btools軟件繪制繪制Circos圖，并計算CqAPX基因家族成員之間共線基因?qū)Φ腒a/Ks。

1.4基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

通過MEME（https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html）網(wǎng)站對CqAPX蛋白進(jìn)行保守基序搜索。提取CqAPX基因家族成員的基因組DNA序列和CDS序列，使用TBTools軟件將其可視化。

1.5系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

擬南芥APX蛋白獲取于TAIR（https：//www.arabidopsis.org/），水稻和藜麥APX蛋白序列獲取于Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/），使用MEGA7.0軟件中的相鄰連接法（Neighbor-Joing）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap設(shè)置為1000次。

1.6啟動子順式作用元件分析

使用TBtools中的gff3序列提取工具，提取CqAPX基因家族成員 CDS上游2000bp提交到PlantCare（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件預(yù)測。

1.7不同組織和脅迫表達(dá)模式分析

從NCBI下載藜麥生長發(fā)育過程中各組織器官及非生物脅迫條件下、地上和根組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)（SRP226463 ， SRP116149），以RNA-Seq數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，分析CqAPX基因家族各成員的組織表達(dá)，并繪制CqAPX基因家族的表達(dá)熱圖，同時對不同脅迫下CqAPX基因的表達(dá)進(jìn)行模式分析。

2結(jié)果與分析

2.1基因家族成員鑒定

本研究共鑒定到19個CqAPX基因，根據(jù)染色體位置命名為CqAPX1～19，且所翻譯蛋白的氨基酸數(shù)目介于199～540之間，等電點范圍在5.21 ～ 9.19之間，。CqAPX蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，主要位于葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、和線粒體。

2.2 基因染色體定位和基因復(fù)制

CqAPX基因家族的共線性分析結(jié)果顯示（圖1），CqAPX基因家族成員分布在3、4、6、7、10、15、17、18號染色體上。根據(jù)串聯(lián)重復(fù)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，CqAPX基因家族中不存在串聯(lián)重復(fù)基因?qū)ΑＪ褂肕CScanX得到了6對片段重復(fù)基因?qū)Γ夜簿€基因?qū)Φ腒a/Ks均小于1（表2），說明CqAPX基因家族的受到純化選擇的影響。

另外，C.quinoa與C. suecicum、C. pallidicaule的共線性分析結(jié)果顯示（圖2），11個CqAPX基因與兩個祖先種均存在同源性，CqAPX15可能起源于C. suecicum，而CqAPX8、CqAPX6、CqAPX10、CqAPX7和CqAPX13可能起源于C. pallidicaule。

2.3基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析

對CqAPX基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)及蛋白序列分析結(jié)果顯示（圖3），位于同一進(jìn)化分支的基因結(jié)構(gòu)和保守基序高度相似，不同進(jìn)化分支之間的CqAPX基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序存在較大差異，這或許也暗示了其在功能上的相似性和互補(bǔ)。CqAPX7、CqAPX15、CqAPX6、CqAPX2和CqAPX19的基因結(jié)構(gòu)較為簡單，且所翻譯蛋白的保守基序種類相較少。CqAPX基因外顯子數(shù)目為 3～18個，8個CqAPX基因含有因同時具有上游和下游UTR，表明CqAPX基因可能具有多樣化的調(diào)控機(jī)制。

2.4系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系

為了進(jìn)一步了解CqAPX基因家族的進(jìn)化族譜和功能關(guān)聯(lián)，使用來自藜麥、擬南芥、水稻的APX蛋白全長氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，共分為4個亞類。A亞類有7個 CqAPX蛋白，其中 CqAPX1和CqAPX3蛋白與擬南芥 AtAPX6蛋白親緣關(guān)系較近。B亞類由 5 個CqAPX蛋白組成。C亞類中只含有1個CqAPX蛋白與水稻OsAPX1蛋白同源性較高，D亞類中含有6個CqAPX蛋白；其中CqAPX1和CqAPX3蛋白與擬南芥AtAPX6蛋白的同源性較高，因此可以看出藜麥與雙子葉植物擬南芥的親緣關(guān)系更近，并且處于同一分支上的可能具有相似的生物學(xué)功能。C和D兩個亞類中均存在藜麥、擬南芥和水稻的APX蛋白，說明部分藜麥APX出現(xiàn)在單子葉植物和雙子葉植物尚未分化前。

2.5啟動子順式作用元件分析

為了更深入了解CqAPX基因家族各成員的潛在生物學(xué)功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對啟動子區(qū)域內(nèi)順式作用元件進(jìn)行分析，如圖4顯示，CqAPX基因順式元件可以分為四種類型。第一種是數(shù)量最多的光響應(yīng)元件，CqAPX8和CqAPX9啟動子區(qū)光響應(yīng)元件最多，達(dá)20個。第二類是激素響應(yīng)元件，包括茉莉酸甲酯、赤霉素，生長素、脫落酸等，其中茉莉酸甲酯最多其次是脫落酸。第三類是與植物發(fā)育相關(guān)的元件，包括分生組織、花序和種子特異性元件，例如CqAPX2、CqAPX14啟動子區(qū)域具有種子特異性調(diào)控元件，第四類是逆境應(yīng)答相關(guān)元件，主要是與干旱誘導(dǎo)、厭氧反應(yīng)、低溫、抵御逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件。CqAPX16-19啟動子區(qū)域內(nèi)具有防御和應(yīng)激反應(yīng)元件、CqAPX18啟動子區(qū)有較多的低溫響應(yīng)元件，CqAPX2、CqAPX4啟動子區(qū)域具有干旱相關(guān)元件。

2.6基因表達(dá)模式分析

CqAPX基因在不同組織和器官中的表達(dá)模式表明（圖6），處于進(jìn)化同一分支的CqAPX表達(dá)模式較為相似，主要在花序、葉柄、干種子、莖和節(jié)間莖中表達(dá)。因此，CqAPX基因在藜麥的生長、發(fā)育和繁殖中起著關(guān)鍵作用。CqAPX基因?qū)Ψ巧锩{迫響應(yīng)模式的分析結(jié)果如圖7所示，CqAPX對干旱、熱和鹽脅迫均有響應(yīng)，但熱誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)更為顯著。無論是地上部分還是根中CqAPX12、CqAPX18和CqAPX9在各種非生物脅迫下表達(dá)量均上調(diào)。鹽脅迫下，大部分CqAPX成員在地上組織中下調(diào)但在根中的表達(dá)量上調(diào)，例如CqAPX10、CqAPX2和CqAPX17。干旱脅迫下，在地上組織CqAPX2和CqAPX13顯著下調(diào)，但在根中則相反。

3結(jié)果與討論

在活性氧種類中，H2O2主要被APX和CAT清除，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[11] 。為了解和提高藜麥的抗非生物脅迫能力，對藜麥基因組所有APX基因家族成員內(nèi)含子數(shù)量、長度、位置以及CDS的總體情況（圖3）進(jìn)行比較分析，可以看出部分CqAPX基因家族成員含有較少的內(nèi)含子，由于脅迫相關(guān)基因內(nèi)含子數(shù)量的增加導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄所需的時間增長，這反過來又推遲了脅迫響應(yīng)[12]，推測藜麥部分APX基因在進(jìn)化過程中形成更為簡單的基因結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)植物抗逆性。物種系統(tǒng)發(fā)育樹中CqAPX1和CqAPX3與擬南芥AtAPX6具有較高的同源性（圖4）。CqAPX1、CqAPX3和CqAPX8在種子中高表達(dá)，這與Chen等[13]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬南芥 AtAPX6在種子后成熟期的表達(dá)量非常豐富的結(jié)果具有一致性。CqAPX12和CqAPX9干旱脅迫下表達(dá)量上調(diào)，與Yan等[14]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AtAPX3的煙草在適度干旱條件下種子產(chǎn)量增加結(jié)果相似。基因的復(fù)制是導(dǎo)致物種基因差異的主要因素，當(dāng)物種受到選擇壓力和限制性生長條件時，這些差異變得更加明顯。從共線性分析來看，在CqAPX基因家族中并不存在近端或分散復(fù)制中的串聯(lián)（圖1），主要以片段復(fù)制形式存在，是基因家族成員擴(kuò)增的驅(qū)動因素之一，且Ka/Kslt;lt;1受純化選擇的影響（表2）。根據(jù)CqAPX在生長和組織的不同階段的表達(dá)模式圖分析顯示CqAPX具有組織特異性表達(dá)。例如，分別在花序和種子、葉柄、莖中高表達(dá)，并且CqAPX5和CqAPX18、CqAPX10和CqAPX13在不同組織中表現(xiàn)出呈現(xiàn)出高相似性（圖5），這與其分布在同一亞組且在基因結(jié)構(gòu)的高相似性相關(guān)聯(lián)（圖3，圖4），體現(xiàn)了其在功能上的一致性。正如Caverzan記錄的[15]，APX基因家族不同成員在不同的發(fā)育階段刺激下于不同的組織中得到響應(yīng)。APX基因在非生物脅迫響應(yīng)時具有廣泛的應(yīng)答，例如CqAPX18和CqAPX12在干旱、熱和鹽脅迫下表達(dá)量都顯著上調(diào)，但部分CqAPX也顯示了應(yīng)激特異性反應(yīng)，例如CqAPX16和CqAPX11只在熱脅迫下顯著上調(diào)（圖7）。順式調(diào)控元件是基因表達(dá)動態(tài)網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的關(guān)鍵開關(guān)，在非生物和生物反應(yīng)、激素反應(yīng)和植物發(fā)育過程中，不同的轉(zhuǎn)錄因子與順式調(diào)控元件相互作用，決定轉(zhuǎn)錄啟動事件。在CqAPX基因家族中，除了生長相關(guān)的元件外，非生物脅迫（低溫、干旱、厭氧、應(yīng)激與防御）響應(yīng)的順式元件大量存在。盡管總體上它們的數(shù)量不同，同時對于非生物脅迫的響應(yīng)也從CqAPX在非生物脅迫下的表達(dá)圖譜中得到了間接印證。此外，在水稻中的研究結(jié)果中表明，ABA顯著增強(qiáng)了OsAPX1的表達(dá)[16]，而藜麥中所有APX啟動子均含有脫落酸響應(yīng)元件，由此可推斷ABA可能會顯著誘導(dǎo)CqAPX的表達(dá)。綜上所述本研究對CqAPX基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，為藜麥的抗逆分子育種和CqAPX基因家族參與應(yīng)答外界脅迫的分子機(jī)制研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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Genome Wide Identification and Expression Pattern Analysis of Ascorbate Oxidase Gene Family of Quinoa（Chenopodium quinoa Willd. ）

LIU Wenli， CHEN Fangjun， GUO Shanli， CHEN Shihua

（School of Life Sciences， Yantai University， Yantai， Shandong， 264005）

Abstract：In order to explore the structure and function of quinoa APX （CqAPX） gene， bioinformatics methods and public databases were used to analyze the physicochemical properties， conserved motifs， gene structure and cis-elements， and expression profiles of members of the CqAPX gene family. The results show that CqAPX has high evolutionary conservatism and can be divided into four taxa. In addition， the promoter of the CqAPX gene is rich in stress-related cis-acting elements， and quinoa APX gene is tissue-specific expression in roots， leaves， tidbits， and seeds. Drought， salt， and heat stress treatments significantly altered the expression of CqAPX genes.

Key word：Ascorbate peroxidase; Quinoa; Gene family; Abiotic stress