櫛孔扇貝Tssk2基因的序列特征及表達分析

摘 要：為研究櫛孔扇貝（Chlamys farreri）Tssk2（睪丸特異性絲氨酸/蘇氨酸激酶2）基因的序列和表達模式，利用熒光定量PCR及生物信息學分析研究了該基因的序列特征、各組織表達和性腺周期表達，結果顯示：該基因CDS為723 bp，編碼240個氨基酸；進化樹顯示，櫛孔扇貝Tssk2蛋白的進化地位與生物學分類地位一致；櫛孔扇貝Tssk2具有Tssk家族的S_TKc保守結構域，含絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性區域（VIb區域）和ATP結合區，但ATP結合區域缺少Ⅰ子域。Tssk2在櫛孔扇貝各組織和性腺發育周期中的表達顯示，精巢是Tssk2表達量最高的組織，尤其是成熟期精巢中表達量最高，推測Tssk2在成熟精巢中發揮重要作用，或與精子的成熟相關。

關鍵詞：櫛孔扇貝；Tssk2；序列特征；表達

中圖分類號：S917.4 " " " " " " " "文獻標志碼：A

Tssk2（testis-specific serine/threonine-protein kinase 2），即睪丸特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2，屬于睪丸特異性絲/蘇氨酸蛋白激酶家族（testis-specific serine /threonine kinase，TSSKs），生物信息學分析表明，該家族成員共享保守的催化結構域（S_TKc domain）[1]，且大多數僅在睪丸或精子中特異高表達[1-4]。研究已表明TSSKs家族在哺乳動物精子發生中起著基礎性作用，如Tssk1和Tssk2雙缺失導致小鼠雄性不育[5]，Tssk6基因缺失導致精子中某些形態缺陷進而導致男性不育表型[6]等。

Tssk2在小鼠（Mus muscculus）中被首次發現，目前為止，對于該基因的深入研究主要集中在哺乳動物中，已經在人（Homo sapiens）[2]、小鼠[2]、豬（Sus scrofa）[1]、樹鼩（Tupaia belangeri）[3]中進行了相關研究，研究均顯示Tssk2高表達于睪丸或精子，其中在人和小鼠中的研究已深入到功能方面，認為Tssk2基因可能參與了晚期精細胞向精子的分化[2，7]。而Tssk2在貝類中的研究甚少，僅通過NCBI數據庫發現砂海螂（Mya arenaria）、斑馬貽貝（Dreissena polymorpha）、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）、葡萄牙牡蠣（Crassostrea angulata）、巨海扇蛤（Pecten maximus）和蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）[8]的Tssk2序列，無進一步研究，BOUTET等研究了紫扇貝（Argopecten purpuratus）中包含Tssk2在內多種生殖特異性基因的表達特征，顯示Tssk2高表達于睪丸，但其文獻中未展示Tssk2具體的序列[9]。

本研究利用生物信息學方法分析櫛孔扇貝（Chlamys farreri）Tssk2基因編碼區特征，探究該基因的功能保守區；并進行組織和性腺發育周期的表達分析，結合上述分析，推測該基因在櫛孔扇貝性腺發育中的作用。

1材料與方法

1.1材料

櫛孔扇貝購自煙臺大學海鮮市場，選擇活力較好的個體，用過濾海水清洗并暫養過夜。取發育同步的增殖期櫛孔扇貝的外套膜、閉殼肌、鰓、肝胰腺和腎組織，雌雄分別取樣，液氮冷凍存放于-80 ℃冰箱，用于提取總RNA[10-11]。分別取各個發育時期的雌雄性腺，一部分置于Bouin’s液固定，組織切片對發育時期進行鑒定[12]；剩余部分液氮冷凍存放于-80 ℃冰箱，用于提取性腺總RNA。上述樣本取樣數各為五個。

1.2總RNA的提取與cDNA的合成

用RNA提取試劑盒提取各組織RNA，試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司。得到的RNA經過凝膠電泳檢測其完整度，微量分光光度計檢測其濃度與純度。選取質量合格的RNA用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，并保存于-20 ℃冰箱備用，反轉錄試劑盒購自Takara。

1.3 Tssk2序列特征分析

利用本實驗室已有櫛孔扇貝轉錄組數據 ，進行序列分析和引物設計。利用Clustal X和DNAMAN軟件進行同源序列比對；利用Clustal X和MEGA 7.0軟件，以鄰接法 （Neibor-joining，NJ）根據不同物種的Tssk2蛋白的氨基酸序列進行進化樹構建。

1.4 各組織及性腺發育周期的qRT-PCR

Tssk2的qRT-PCR引物為sq3/sq4（表1），內參基因β-actin的qRT-PCR引物為A1/A2。雌雄扇貝每種組織以及不同發育時期的性腺設計3個樣品重復，2個技術重復，內參基因同上。使用Roche 480熒光定量PCR儀檢測，反應程序：95 ℃，10 min、（95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；72 ℃，30 s）×40。采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量，利用SPSS軟件中One-way ANOVA進行顯著性分析，最小顯著差法（Least Significant Difference， LSD）多重檢驗法進行統計分析（Plt;0.05為顯著水平）。

2.結果與分析

2.1 Tssk2基因CDS序列特征分析

如圖1所示，櫛孔扇貝Tssk2基因CDS長723 bp，編碼240個氨基酸。不同物種Tssk2蛋白序列多重比對顯示（圖2）：同其他絕大多數物種一樣，櫛孔扇貝Tssk2的S_TKC保守區中也含VIb區域和ATP結合區，以及兩個區域中分別對應的保守氨基酸天冬氨酸和賴氨酸，但ATP結合區域缺少Ⅰ子域，蝦夷扇貝Tssk2的S_TKC保守區顯示缺少整個ATP結合區。

2.2系統進化分析

如圖3所示，櫛孔扇貝（翼形亞綱扇貝目足扇貝亞科）Tssk2蛋白首先與蝦夷扇貝（翼形亞綱扇貝目足扇貝亞科）Tssk2蛋白聚類，再與巨海扇蛤（翼形亞綱扇貝目扇貝亞科）聚類，之后與斑馬貽貝（異齒亞綱海螂目）聚類，最后與其它物種的Tssk2蛋白聚類，這一結果顯示系統進化關系與物種分類地位基本一致。

2.3 Tssk2基因熒光定量PCR結果

如圖4所示，Tssk2基因在增殖期雌雄各組織中都有表達，在雌性個體中，卵巢、肝和腮中表達較高，在其他組織中表達相對較低；在雄性個體中，精巢表達量顯著高于其它組織（Plt;0.05）。如圖5所示，Tssk2基因在卵巢各發育時期表達量很低且無顯著差異；在精巢各發育時期中，增殖期與生長期表達量較低，成熟期精巢表達量較高，顯著高于其他發育時期的精巢和卵巢（Plt;0.05）。

3討論

對于人、小鼠、鳥類、硬骨魚類等物種的Tssk2蛋白序列分析發現，均具有S_TKC結構域，該結構域可催化γ-磷酸化基從ATP轉移到蛋白質底物上的絲氨酸/蘇氨酸殘基，在不同物種中以及TSSKs家族中都很保守[7]，S_TKC結構域有VIb區域和ATP結合區域兩個重要部分。ATP結合區域具有保守賴氨酸殘基，參與ATP結合，VIb區域具有保守天冬氨酸殘基，對其發揮酶的催化活性起到重要作用。櫛孔扇貝Tssk2蛋白中含保守的VIb區域，但與其他物種相比（如圖2所示），櫛孔扇貝Tssk2缺少組成ATP結合區域的Ⅰ子域。在人和小鼠中，ATP結合區域通過保守的賴氨酸殘基與ATP結合，進而獲得ATP的磷酸基團，再將該磷酸基團轉移到靶蛋白的特異位點上，發揮Tssk2的磷酸化功能[2]。對海灣扇貝（Argopecten irradians）Tssk5研究發現，其S_TKc結構域有保守的賴氨酸殘基，但沒有ATP結合區，卻也能參與ATP的結合[4]，故雖然櫛孔扇貝中Tssk2的ATP結合域不完整，但其在相應位置上存在的保守的賴氨酸殘基，推測櫛孔扇貝Tssk2如上述海灣扇貝的Tssk5一樣仍能繼續發揮作用，保障Tssk2功能的行使。WANG等人通過蝦夷扇貝的組學測序，發現了Tssk2基因序列[8]，顯示蝦夷扇貝Tssk2的ATP結合區域完全缺失，該區域完全缺失是否影響Tssk2功能的發揮，目前尚無相關研究。如圖2所示，軟體動物門雙殼綱中異齒亞綱的砂海螂及斑馬貽貝、翼形亞綱牡蠣目的太平洋牡蠣及葡萄牙牡蠣 、翼形亞綱扇貝目扇貝亞科的巨海扇蛤都具有完整的ATP結合區域，但翼形亞綱扇貝目足扇貝亞科的櫛孔扇貝和蝦夷扇貝都出現了ATP結合區域不同程度的缺失，由于目前缺少足扇貝亞科其他物種Tssk2的序列研究（BOUTET等只研究了紫扇貝Tssk2的表達，文獻中并無序列，且NCBI數據庫也無相關序列信息），是否櫛孔扇貝和蝦夷扇貝Tssk2的這種缺失是足扇貝亞科特有的，還是這兩個物種特有的，尚需進一步探究。

如前言所述，Tssk2在眾多等物種中都特異性高表達于睪丸或精子[1，2，3，9]。XUE等人通過qRT-PCR檢測了海灣扇貝Tssk家族眾多基因Tssk3、Tssk4、Tssk5、Tssk7以及Tssk1/2在性腺中的表達，研究者并未對Tssk1/2進行明確的亞家族歸類，但發現Tssk1/2主要在精巢表達，尤其是在成熟期的精巢組織中的表達量最高，生長期其次[4]。本研究發現，櫛孔扇貝中精巢Tssk2基因的表達量顯著高于其他組織，且在精巢的成熟期表達量顯著高于其他性腺發育時期，研究結果較為吻合。有研究檢測到小鼠Tssk2基因除了在睪丸中豐富表達外，在其他組織中也有少量表達[14]；SHARPER等人對小鼠的研究也發現，相較于睪丸，Tssk2基因在小鼠肌肉組織中也有少量表達[15]；本研究也發現該基因在櫛孔扇貝的除性腺外的其他組織也有表達，至于這種低水平的表達是否具有明顯的生理學意義尚需要進一步研究。

LI等通過免疫組化定位了小鼠精子中的Tssk2蛋白，發現其分布在精子頭部的頂體后區[2]。頂體后區富含聚合肌動蛋白，而且參與精卵融合的Izumo蛋白在頂體反應后遷移到該區域[16，17]，推測在小鼠中Tssk2的具體作用發揮可能與精子運動及未來的精卵融合密切相關。有文獻顯示，在人和小鼠中，SPAG16L蛋白是鞭毛運動所必需的軸心中樞蛋白，該蛋白在體外可以被Tssk2磷酸化，也證明Tssk2可能與精子的運動有關[18]；同時研究發現，人體中Tssk2能使睪丸特異性激酶底物（TSKS）磷酸化，進而導致TSKS蛋白活化，促進鞭毛的發生[18]，認為鞭毛發生過程中，Tssk2和TKSK共同發揮了作用，通過鞭毛生物發生參與了精子運動。上述機理研究印證了小鼠和人的Tssk2基因均在雄性生殖細胞中的精子成熟階段高表達，表明Tssk2基因在精子成熟中發揮了重要作用，櫛孔扇貝Tssk2基因在精巢周期中具有類似的表達模式，暗示了Tssk2基因在櫛孔扇貝精子成熟中也可能發揮重要作用，但具體生物功能尚需進一步開展研究。

參考文獻：

[1] WANG P， HUO H L， WANG S Y， et al. Cloning， sequence characterization， and expression patterns of members of the porcine TSSK family[J].Genet Mol Res，2015，14（4）：14908-14919.

[2] LI Y H， SOSNIK J， BRASSARD L， et al. Expression and localization of five members of the testis-specific serine kinase （Tssk） family in mouse and human sperm and testis[J]. Molecular Human Reproduction， 2011， 17（1）： 42-56.

[3] LI X， LI Y J， SONG W F， et al. cDNA cloning， expression and bioinformatical analysis of Tssk genes in tree shrews[J]. Computational Biology and Chemistry， 2021， 92： 107474.

[4] XUE X R， ZHANG L L， LI Y J， et al. Expression of the testis-specific serine/threonine kinases suggests their role in spermiogenesis of bay scallop Argopecten irradians[J]. Frontiers in Physiology， 2021， 12： 657559.

[5] XU B F， HAO Z L， JHA K N， et al. Targeted deletion of Tssk1 and 2 causes male infertility due to haploinsufficiency[J]. Developmental Biology， 2008， 319（2）： 211-222.

[6] SOSNIK J， MIRANDA P V， SPIRIDONOV N A， et al. Tssk6 is required for Izumo relocalization and gamete fusion in the mouse[J]. Journal of Cell Science， 2009， 122（Pt15）： 2741-2749.

[7] KUENG P， NIKOLOVA Z， DJONOV V， et al. A novel family of serine/threonine kinases participating in spermiogenesis[J]. The Journal of Cell Biology， 1997， 139（7）： 1851-1859.

[8] WANG S， ZHANG J B， JIAO W Q， et al. Scallop genome provides insights into evolution of bilaterian karyotype and development[J]. Nature ecology amp; evolution， 2017， 1（5）： 1-12.

[9] BOUTET I， MORAGA D， MARINOVIC L， et al. Characterization of reproduction-specific genes in a marine bivalve mollusc： influence of maturation stage and sex on mRNA expression[J]. Gene， 2008， 407（1-2）： 130-138.

[10] 贠晗， 李嘉欣， 羅冬艷， 等. 櫛孔扇貝STS基因的CDS序列特征及表達[J].煙臺大學學報（自然科學與工程版），2022，35（4）：428-433.

[11] 慕雪嬌， 劉曉玲， 贠晗， 等. 櫛孔扇貝FTZ-F1基因的序列特征及表達分析[J].海洋漁業，2021，43（4）：430-441.

[12] 廖承義， 徐應馥， 王遠隆. 櫛孔扇貝的生殖周期[J]. 水產學報， 1983， 7（1）： 1-13.

[13] HANKS S K， HUNTEr T. The eukaryotic protein kinase superfamily： kinase （catalytic） domain structure and classification 1[J]. The FASEB journal， 1995， 9（8）： 576-596.

[14] SPIRIDONOV N A， WONG L， ZERFAS P M， et al. Identification and characterization of SSTK， a serine/threonine protein kinase essential for male fertility[J]. Molecular and Cellular Biology， 2005， 25（10）： 4250-4261.

[15] SHARPE R M. Regulation of spermatogenesis[J]. The physiology of reproduction， 1994.

[16] SALICIONI A M， GERVASI M G， SOSNIK J， et al. Testis-specific serine kinase protein family in male fertility and as targets for non-hormonal male contraception[J]. Biology of Reproduction， 2020， 103（2）： 264-274.

[17] MIRANDA P V， ALLAIRE A， SOSNIK J， et al. Localization of low-density detergent-resistant membrane proteins in intact and acrosome-reacted mouse sperm[J]. Biology of Reproduction， 2009， 80（5）： 897-904.

[18] ZHANG Z B， SHEN X N， JONES B H， et al. Phosphorylation of mouse sperm axoneme central apparatus protein SPAG16L by a testis-specific kinase， TSSK2[J]. Biology of reproduction， 2008， 79（1）： 75-83.

[19] XU B F， HAO Z L， JHA K N， et al. TSKS concentrates in spermatid centrioles during flagellogenesis[J]. Developmental Biology， 2008， 319（2）： 201-210.

[20] SHANG P， BAARENDS W M， HOOGERBRUGGE J， et al. Functional transformation of the chromatoid body in mouse spermatids requires testis-specific serine/threonine kinases[J]. Journal of cell science， 2010， 123（3）： 331-339.

[21] SHANG P， HOOGERBRUGGE J， BAARENDS W M， et al. Evolution of testis-specific kinases TSSK1B and TSSK2 in Primates[J]. Andrology， 2013， 1（1）： 160-168.

[22] 黃實， 蘇金珠， 李亞輝. 睪丸特異性絲/蘇氨酸蛋白激酶家族研究進展[J]. 云南農業大學學報 （自然科學）， 2012， 27（3）： 424-429.

Sequence Characteristics and Expression Analysis of Tssk2 Gene in Chlamys farreri

XING Yan， WANG Chunyu， LUO Dongyan， LIU Xiaoling*

（School of Life Sciences， Yantai University， Yantai 264005， China）

Abstract： In order to study the sequence and expression pattern of Tssk2 （testis-specific serine/threonine-protein kinase 2） gene in Chlamys farreri， the sequence characteristics， tissue expression and gonadal cycle expression of Tssk2 gene are studied by qRT-PCR and bioinformatics analysis. The results are as follows： The CDS（coding sequences） of Tssk2 is 723 bp long and encodes 240 amino acids. Phylogenetic analysis shows that the evolutionary status of Tssk2 protein in C. farreri is consistent with its biological classification status. Tssk2 possesses the S_TKc conserved domain of the TSSKs， including the serine/threonine protein kinase active region （VIb region） and ATP-binding region， but the ATP-binding region lacks the Ⅰ subdomain. The expression of Tssk2 gene in various tissues and gonadal development cycles of C. farreri show that Tssk2 expression is the highest in the sperms， especially in the sperms at maturity， which shows that this gene may play a key role inmature testes and/or is relates to sperm maturation.

Key words：Chlamys farreri; Tssk2; sequence feature; expression