簇集素濃度與顱腦損傷嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

田和平，鐘琦，周海航，王耿煥

嘉興市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江嘉興 314000

簇集素（clusterin，CLU）作為一種多功能分泌糖蛋白，具有調(diào)節(jié)凋亡、細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等多種生理功能，在多種病理狀態(tài)下表達(dá)水平升高，目前發(fā)現(xiàn)CLU在阿爾茨海默病、腦梗死、腦出血、多發(fā)性硬化、癲癇等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均呈高表達(dá)且發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用[1-2]。但其在顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）后是否表達(dá)以及能否發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用等少有報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)急性中重度TBI后患者的血清及腦脊液CLU濃度，分析其與格拉斯哥昏迷評(píng)分（Glasgow coma score，GCS）、腦挫裂傷體積、鹿特丹CT評(píng)分的相關(guān)性，探討CLU在TBI中的表達(dá)及與TBI嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年9月至2020年10月嘉興市第二醫(yī)院收治的102例急性中重度TBI患者納入研究并進(jìn)行前瞻性隊(duì)列研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有TBI病史；②顱腦CT檢查確診為T(mén)BI；③傷后12h內(nèi)入院；④首次GCS評(píng)分3～12分；⑤年齡20～70歲；⑥簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①神經(jīng)系統(tǒng)疾病、凝血功能障礙、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、皮膚病者；②休克、生命體征不穩(wěn)定者；③中途退出或資料不完整者。按時(shí)間順序分為2個(gè)批次，第一批20例，行CLU在TBI后血清中時(shí)間表達(dá)研究，其中男12例，女8例；年齡20～61歲，平均（45.15±12.24）歲；體質(zhì)量指數(shù)19.84～ 23.95kg/m2，平均（22.12±1.47）kg/m2；病史：高血壓6例（30%），糖尿病2例（10%）。同期選取在嘉興市第二醫(yī)院行體格檢查的20名體檢者為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：同病例納入標(biāo)準(zhǔn)⑤和⑥；排除標(biāo)準(zhǔn)：同病例排除標(biāo)準(zhǔn)；其中男14名，女6名；年齡22～70歲，平均（43.75±12.98）歲；體質(zhì)量指數(shù)20.70～ 23.82kg/m2，平均（22.40±1.85）kg/m2；病史：高血壓4例（20%），糖尿病4例（20%）。第一批患者與對(duì)照組體檢者之間的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。第二批82例，參照第一批時(shí)間表達(dá)圖于血清CLU高表達(dá)時(shí)間行血清、腦脊液檢測(cè)，根據(jù)首次GCS評(píng)分分為兩組，按鹿特丹CT評(píng)分分為三組，按腦挫裂傷體積分為兩組；各組間患者的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。本研究經(jīng)嘉興市第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批號(hào)：JXEY-2019JX161）。

表1 第二批患者組間一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 臨床資料的收集 采集首次GCS評(píng)分、鹿特丹CT評(píng)分、腦挫裂傷體積評(píng)估患者的TBI嚴(yán)重程度。GCS評(píng)分計(jì)分范圍：3～15分；鹿特丹CT評(píng)分計(jì)分范圍：1～6分；腦挫裂傷（顱腦CT掃描采集，CT值19～82Hu）體積=ABC/2（A：挫裂傷灶最大直徑；B：挫裂傷灶上與最大直徑垂直的最寬徑；C：CT軸位上挫裂傷灶累及的層面數(shù)×1cm），多處腦挫裂傷體積為單個(gè)病灶體積的總和。資料收集由本院兩名高年資神經(jīng)外科醫(yī)生完成。

1.2.2 標(biāo)本的采集 血清：第一批患者為T(mén)BI后連續(xù)4d的晨血，對(duì)照組為健康體檢者化驗(yàn)剩余的血清，第二批患者為參照第一批CLU時(shí)間圖上CLU高表達(dá)時(shí)間采集晨血；外周靜脈血2ml，置于促凝管中靜置2h，3000轉(zhuǎn)/min離心15min，吸取上層血清，采用上海生工血清白蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒純化血清樣本，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，置于-80℃冰箱備用。腦脊液：第二批患者參照第一批CLU時(shí)間圖上CLU高表達(dá)時(shí)間當(dāng)天腰椎穿刺收集腦脊液2ml，2000轉(zhuǎn)/min離心10min，置于-80℃冰箱備用。

1.2.3 Western blot法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)CLU的表達(dá) Western blot法：取血清蛋白樣本各50g，經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離后電泳轉(zhuǎn)移至硝化纖維素濾膜（購(gòu)自美國(guó)Amersham公司，孔徑：0.2μm），用5%脫脂牛奶封閉后，特異性一抗，CLU小鼠抗人單克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)Quidel公司）或內(nèi)參照β-actin（購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司）孵育4℃過(guò)夜。之后三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（tris-buffered saline Tween-20，TBST）洗膜3次，每次15min，孵育二抗山羊抗小鼠lgG（購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）2h，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光儀（購(gòu)自美國(guó)Amersham公司）曝光顯影。用UVP imagestore7500成像系統(tǒng)成像，Chemilmager5500軟件分析條帶吸光度A值。ELISA：用CLU-ELISA試劑盒（購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司）檢測(cè)樣本吸光度并計(jì)算CLU水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)或F檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q1，Q3）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；Spearman相關(guān)系數(shù)分析CLU濃度與其他因素的相關(guān)性；多元線性回歸分析影響CLU濃度的因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot法檢測(cè)第一批患者TBI后不同時(shí)間的血清CLU含量

與對(duì)照組入選者比較，第一批患者的血清CLU含量在TBI后1d增加并持續(xù)至傷后2d，于傷后3d顯著增加，約為對(duì)照組的3.5倍，傷后4d含量下降，見(jiàn)圖1。TBI傷后不同時(shí)間患者的血清CLU含量與對(duì)照組入選者分別進(jìn)行兩兩比較，傷后1d、2d、3d與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；傷后3d分別與1d、2d比較，CLU差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明CLU在患者TBI后3d血清中顯著表達(dá)。

圖1 Western blot法檢測(cè)中重度顱腦損傷后患者的血清CLU表達(dá)

2.2 按不同評(píng)估方法分組，比較組間血清、腦脊液CLU濃度

TBI后患者的血-腦脊液屏障被破壞，血清、腦脊液中蛋白表達(dá)時(shí)間基本一致，因血清CLU含量于傷后3d達(dá)到峰值，于是選取傷后3d這一時(shí)間采集第二批患者的血清、腦脊液，通過(guò)ELISA檢測(cè)CLU濃度。按GCS評(píng)分分組的中度（9～12分）、重度（3～8分）兩組和按鹿特丹CT評(píng)分分組的1～2分、3～4分、5～6分三組及按腦挫裂傷體積分組的<15ml、≥15ml兩組之間的患者血清CLU濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖2A、C、E；腦脊液CLU濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且GCS評(píng)分重度組腦脊液CLU濃度高于中度組，見(jiàn)圖2B，鹿特丹CT評(píng)分的三組中腦脊液CLU濃度在5～6分組最高，3～4分組次之，1～2分組最低，見(jiàn)圖2D，腦挫裂傷體積≥15ml組腦脊液CLU濃度高于<15ml組，見(jiàn)圖2F。

圖2 按不同評(píng)估方法分組后比較TBI后患者的CLU濃度

2.3 腦脊液CLU濃度與患者的一般情況、TBI嚴(yán)重程度的相關(guān)性

采集第二批患者的研究數(shù)據(jù)行Spearman相關(guān)性分析顯示，腦脊液CLU濃度與GCS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.542，P<0.05），與鹿特丹CT評(píng)分、腦挫裂傷體積呈正相關(guān)（r=0.414、0.738，P<0.05），見(jiàn)表2、圖3。將上述與腦脊液CLU濃度相關(guān)的因素行多元線性回歸分析，提示回歸方程顯著，F(xiàn)=42.566，P<0.05，TBI后腦挫裂傷體積對(duì)腦脊液CLU濃度的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（β=8.074，P<0.001），見(jiàn)表3。

圖3 TBI患者腦脊液CLU濃度與GCS評(píng)分、鹿特丹CT評(píng)分、腦挫裂傷體積的線性散點(diǎn)圖

表2 Spearman相關(guān)性分析腦脊液CLU濃度與其他因素的相關(guān)性

3 討論

人類(lèi)CLU基因編碼定位于8號(hào)染色體（8p21-p12）上[3]。在發(fā)育和多種疾病病理過(guò)程中，CLU mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)，且表達(dá)上調(diào)的CLU對(duì)心肌細(xì)胞、視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞及肺細(xì)胞等均發(fā)揮重要的細(xì)胞保護(hù)作用[4-9]。CLU在腦組織內(nèi)同樣表達(dá)，且在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中表達(dá)增高，如阿爾茨海默病，Pick病、癲癇、缺血性腦血管病和多發(fā)性硬化等，高表達(dá)的CLU對(duì)缺血缺氧性疾病、退行性疾病均有拮抗作用[2,10-11]。本研究中，TBI后血清中CLU含量逐漸增高，并于傷后3d達(dá)到高峰，因此，CLU在TBI后同樣高表達(dá)。但CLU作為一種應(yīng)激性細(xì)胞保護(hù)蛋白，也在機(jī)體處于緊張或嚴(yán)重應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)增加[12]。為明確CLU含量的增高是TBI后機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致還是與TBI嚴(yán)重程度有關(guān)，本研究對(duì)TBI嚴(yán)重程度與血清CLU含量進(jìn)行相關(guān)分析。在評(píng)估TBI嚴(yán)重程度的方法中，臨床上最常使用GCS評(píng)分，其主要體現(xiàn)大腦的意識(shí)水平，因其缺乏解剖學(xué)及病理生理的客觀資料，所以具有一定的局限性；鹿特丹CT評(píng)分利用頭顱CT的5個(gè)病理解剖學(xué)特征包括環(huán)池的受壓程度、蛛網(wǎng)膜下腔出血或腦室出血、大腦中線移位程度及顱內(nèi)血腫等，直接反映腦損傷的病理解剖學(xué)程度。本研究利用腦挫裂傷體積評(píng)價(jià)腦損傷范圍作為補(bǔ)充，分別于整體意識(shí)水平、病理解剖學(xué)特征、腦損傷范圍等多方面行組間CLU濃度比較[13-14]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBI后不同分組組間患者血清CLU濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因：①CLU廣泛表達(dá)于各組織中，除大腦分泌CLU外，在人體還有多個(gè)臟器如心、肝、脾、肺、前列腺等也可表達(dá)CLU并分泌至血液中；另外，糖尿病、冠心病患者的血液中CLU含量也升高。因此，外周血CLU水平與多個(gè)臟器及系統(tǒng)的病理狀態(tài)相關(guān)，不能單一用腦組織的病理改變來(lái)解釋；②CLU隨腦脊液循環(huán)途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至血液的過(guò)程中可被多種受體攝取，因此，外周血中CLU水平并不能準(zhǔn)確地反映其在腦組織內(nèi)或腦脊液中的真實(shí)表達(dá)[15]。

腦脊液成分的改變可直接反映腦組織的病理變化[16]。腦脊液中CLU含量較低（1.2～3.6μg/ml），Western blot法難以檢測(cè)，因此本研究采用ELISA替代[15]。腰椎穿刺獲取腦脊液是一項(xiàng)有創(chuàng)操作，為減少對(duì)受試者的創(chuàng)傷，本研究?jī)H選取TBI后CLU峰值的單一時(shí)間行腰椎穿刺檢查。結(jié)果表明不管是按意識(shí)水平的GCS評(píng)分分組，還是按病理解剖學(xué)角度、腦損傷范圍行鹿特丹CT評(píng)分、腦挫裂傷體積分組，組間患者腦脊液CLU濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在GCS評(píng)分重度組、鹿特丹CT高評(píng)分組、腦挫裂傷體積較大組，患者腦脊液CLU濃度均較高，表明TBI嚴(yán)重程度加重，腦脊液CLU濃度升高；Spearman相關(guān)性分析表明腦脊液CLU濃度與TBI嚴(yán)重程度的GCS評(píng)分、鹿特丹CT評(píng)分、腦挫裂傷體積均相關(guān)，說(shuō)明CLU在TBI后高表達(dá)，主要體現(xiàn)在腦脊液中，可作為評(píng)估TBI嚴(yán)重程度的指標(biāo)；多元回歸分析發(fā)現(xiàn)腦挫裂傷體積是影響腦脊液CLU的主要因素，表明損傷范圍越大，腦組織CLU表達(dá)越高，可能與傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、聚集表達(dá)CLU有關(guān)[17]。

綜上，腦脊液CLU隨TBI嚴(yán)重程度呈高表達(dá)，且損傷范圍是其主要影響因素，但本研究尚不能明確CLU的細(xì)胞來(lái)源，后續(xù)可進(jìn)一步開(kāi)展細(xì)胞及組織學(xué)研究，以取得更深入的發(fā)現(xiàn)。