芥子咳喘貼早期安全性評價實驗研究

王道涵 袁曉雯 喬艷雪 趙榮華 王素梅 馬雅鑾

(1 北京中醫藥大學東方醫院兒科,北京,100078; 2 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所,北京,100700; 3 中國中醫科學院中藥研究所,北京,100700)

小兒支氣管炎是常見的小兒下呼吸道疾病之一,可由病毒和(或)細菌感染,過敏原刺激以及各種理化因素導致支氣管黏膜損傷而出現的急慢性炎癥。本病預后輕重差別大,小年齡患兒在某些病原體感染后臨床表現較重,預后較差[1-2]。本病西醫治療以對癥處理為主,多依靠口服或靜脈給藥,由于患兒依從性較差,且部分藥物存在一定不良反應,癥狀短期內難以得到理想控制。中醫將本病歸屬“咳嗽”范疇，歷代醫家非常重視外治法的應用，其中，中藥貼敷技術歷史傳承悠久，其通過精準取穴、經皮給藥，避免了藥物在體內的首過效應，具有維持有效藥物濃度時間長，不良反應小的優點[3-4]。國家級名老中醫、著名中醫兒科專家王素梅教授經古方優化及工藝改進，創制而成的芥子咳喘貼是一種治療小兒支氣管炎的有效外用貼劑。為評價該貼劑的安全性，本實驗擬對其進行皮膚急性毒性、皮膚刺激性及皮膚過敏相關試驗研究，為臨床試驗提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康日本大耳白兔20只,體質量2 500～3 000 g;健康Hartley豚鼠30只,體質量250～300 g,受試動物均為清潔級,雌雄各半,購自北京昌揚西山養殖場,實驗動物合格證號:SCXK(京)2011-0010。飼養于中國中醫科學院中醫基礎理論研究所實驗動物中心,實驗動物使用許可證號:SCXK(京)2010-0032。動物飼養室條件:溫度22～25 ℃,濕度40%～60%,通風良好。本實驗經北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會批準(倫理審批號:202022)。

1.1.2 實驗藥物與試劑 芥子咳喘貼,組方:白芥子、延胡索、細辛、干姜、冰片、紫草、甘草,購自北京中醫藥大學東方醫院中藥房,經北京中醫藥大學中藥學院譚鵬副教授負責鑒定;賦形劑,由北京中醫藥大學中藥學院提供。

1.1.3 試劑與儀器 2,4-二硝基氯代苯丙酮液(上海梯希愛化成工業發展有限公司,批號:47HAM-HM);總膽固醇(Total Cholesterol,TC)試劑盒(批號:CH0101152),三酰甘油(Triglyceride,TG)試劑盒(批號:CH0101151),高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein,HDL)試劑盒(批號:CH0101161),低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)試劑盒(批號:CH0101162),谷丙轉氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase,GPT)試劑盒(批號:CH0101201),谷草轉氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase,GOT)試劑盒(批號:CH0101202),以上試劑盒均購自四川邁克生物科技公司。尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)試劑盒(批號:HY-N0015),肌酐(Creatinine,CRE)試劑盒(批號:HY-N0017),以上試劑盒購自北京華英生物技術研究所;尿酸(Uric Acid,UA)試劑盒(批號:C01221),購自南京建成生物工程研究所;蘇木精-伊紅(Hematoxylin and Eosin,HE)染色試劑(批號:G1120),購自北京索萊寶有限公司;全自動生化分析儀(Beckman Coulter公司,美國,型號:CX4);型電子分析天平(METTLER TOLEDO公司,瑞士,型號:LE204E);手提式高壓滅菌鍋(上海比朗儀器有限公司,型號:YXQ-SG46-280);寵物電推剪(深圳市科德士電子廠,型號:CP-9600)。

1.2 方法

1.2.1 皮膚用藥急性毒性試驗 選擇日本大耳白兔12只,雌雄各半,試驗前24 h將日本大耳白兔臀背部沿脊柱兩側脫毛,每側脫毛面積約15 cm×10 cm,脫毛后檢查有無皮膚劃傷并剔除劃傷者。給藥當日隨機分為3組并施藥物,每組4只。空白對照組(賦形劑2 g/只)、芥子咳喘貼常規劑量組(2 g/只)、芥子咳喘貼高劑量組(8 g/只),藥物均勻涂抹于脫毛區,用油紙、紗布、膠布固定,單籠飼養,每日2次,2次用藥間隔6 h,包扎24 h后溫水洗凈,分別于給藥前、給藥后第3天、第7天觀察日本大耳白兔全身中毒表現,包括呼吸,四肢活動,體質量,皮膚,毛發,眼睛,黏膜,脊神經等變化[5-6]。第8天將所有日本大耳白兔心臟取血,取血前禁食12 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉后開胸暴露心臟,用10 mL注射器經左心室抽取血液標本5 mL,測定各組血生化指標并比較組間差異[7-8]。

1.2.2 單次給藥完整皮膚刺激試驗 選擇日本大耳白兔4只,雌雄各半,脫毛方法參照1.2.1。給藥當日每只日本大耳白兔分別沿脊柱左側脫毛區涂以低劑量芥子咳喘貼1 g,右側涂以等量賦形劑作為賦形劑側,包扎24 h后溫水洗凈,并于1、24、48、72 h觀察日本大耳白兔皮膚有無紅斑、水腫現象,以及上述變化的恢復情況和時間,并與賦形劑側進行比較。試驗結果按皮膚刺激性反應評分標準進行評分,計算平均分值,進行刺激強度評價[9-10]。見表1～2。

表1 皮膚刺激性及過敏反應評分標準

表2 皮膚刺激強度評價標準

1.2.3 多次給藥完整皮膚刺激試驗 選擇日本大耳白兔4只,雌雄各半,脫毛及給藥方式參照1.2.2,1次/d,連續7 d,最后1次給藥24 h后溫水洗凈,并于1、24、48、72 h觀察日本大耳白兔皮膚有無紅斑、水腫,涂抹部位是否有色素沉著、出血點、皮膚粗糙、皮膚菲薄,以及上述變化的恢復情況和時間,并與賦形劑側進行比較。試驗結果按皮膚刺激性反應評分標準進行評分,計算平均分值,進行刺激強度評價。見表1～2。

1.2.4 皮膚過敏試驗 選擇Hartley豚鼠30只,雌雄各半。試驗前24 h將Hartley豚鼠背部沿脊柱兩側脫毛,每側脫毛面積3 cm×3 cm。隨機分為3組并施以藥物,即:空白對照組、陽性對照組、芥子咳喘貼組,每組10只。致敏接觸:取芥子貼膏劑0.2 g涂于動物左側脫毛區,用一層油紙及二層紗布覆蓋固定,持續6 h后溫水洗凈,后于第7、14天以同樣方式重復給藥1次,共3次。空白對照組和陽性對照組以同樣方式分別涂賦形劑0.2 g和2,4-二硝基氯代苯丙酮液0.2 mL。激發方法:末次致敏后,將3種藥物分別等量涂于各自組別動物右側脫毛區,6 h后溫水洗凈,分別于去除藥物后6、24、48、72 h觀察皮膚過敏情況,進行皮膚過敏反應評分和皮膚致敏性評價[11]。見表1,表3。

表3 皮膚致敏性評價標準

2 結果

2.1 急性毒性試驗對日本大耳白兔一般狀況影響 給藥期間及停藥后,各組日本大耳白兔發育正常,毛發光澤,反應機敏,呼吸平穩,飲水、攝食及排便、排尿正常,天然孔道無異常分泌物。動物行為、肌肉緊張力等均未見異常表現。動物眼結膜、口腔黏膜和氣道黏膜未見有分泌物、充血、發紺、黃疸等現象。未見眼瞼下垂,眼球突出、震顫和混濁。各組無動物死亡。

2.2 急性毒性試驗對日本大耳白兔體質量、大體解剖狀況影響 5各組動物體質量平穩增長,給藥前、給藥3 d后和給藥7 d后各組日本大耳白兔體質量差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。日本大耳白兔皮膚、脊神經及各臟器未見明顯異常改變。見圖1。

圖1 各組用藥后各組織病理學檢測結果(HE染色,×100)

表4 芥子咳喘貼對日本大耳白兔體質量的影響

2.3 急性毒性試驗對日本大耳白兔臟器質量及臟器系數影響 與空白對照組和芥子咳喘貼常規劑量組比較,芥子咳喘貼高劑量組肝臟質量明顯降低(P<0.05);與空白對照組比較,芥子咳喘貼高劑量組肺臟質量明顯增加(P<0.05),左右腎臟質量明顯降低(P<0.05);與空白對照組和芥子咳喘貼常規劑量組比較,芥子咳喘貼高劑量組肝臟臟器系數明顯降低(P<0.05);與空白對照組比較,芥子咳喘貼高劑量左右腎臟臟器系數明顯降低(P<0.05),芥子咳喘貼常規劑量組與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表5～6。

表5 各組日本大耳白兔臟器質量比較

表6 各組日本大耳白兔臟器系數比較

2.4 急性毒性試驗對日本大耳白兔血生化指標影響 各組日本大耳白兔血脂(TC、TG、HDL、LDL)、肝功(GPT、GOT)及腎功(BUN、CRE、UA)差異無統計學意義(P>0.05)。見表7～8。

表7 各組日本大耳白兔血脂指標比較

表8 各組日本大耳白兔肝腎功指標比較

2.5 完整皮膚刺激試驗結果 單次給藥結果顯示,全部日本大耳白兔皮膚在各觀察時間點均未出現紅斑、水腫,兩側皮膚刺激評分均為0。多次給藥結果顯示,3只日本大耳白兔皮膚在各觀察時間點均未出現紅斑、水腫,兩側皮膚刺激評分均為0;1只兔子給藥4 d后,芥子咳喘貼側皮膚出現明顯可見紅斑及水腫,給藥7 d后,該側紅斑增多,呈紫紅色并有焦痂,賦形劑側皮膚出現中度到嚴重紅斑,停藥24 h后,芥子咳喘貼側與賦形劑側紅斑數量比為20∶5。停藥72 h后,芥子咳喘貼側紅斑好轉,賦形劑側紅斑加重,二者紅斑數量比為20∶25,其刺激強度平均分值1.5,為輕度刺激。試驗期間各組日本大耳白兔均未出現死亡。

2.6 皮膚過敏試驗結果 芥子咳喘貼組、空白對照組均未引起Hartley豚鼠皮膚出現紅斑、水腫等過敏反應,致敏率均為0。陽性對照組所有Hartley豚鼠在激發6 h后出現皮膚紅斑、水腫,涂抹部位未出現色素沉著、出血點、皮膚粗糙、皮膚菲薄,部分Hartley豚鼠出現中度到嚴重紅斑,水腫隆起超過1 mm,反應級數為3級,48 h后上述過敏癥狀出現減輕反應級數為2級,72 h后明顯消退,表現為輕度紅斑、水腫,反應級數為1級。試驗期間各組Hartley豚鼠均未出現休克和死亡。

3 討論

芥子咳喘貼處方靈感來源于明末清初醫家張璐所著《張氏醫通》里“白芥子散”組方,該貼劑的多個衍生方在臨床廣泛用于小兒急性支氣管炎、咳嗽變異性哮喘、反復呼吸道感染的治療[12-14]。臨床研究證實,芥子咳喘貼適宜小兒急性支氣管炎屬肺經蘊熱證型,對咳嗽、咯痰、喘促癥狀具有顯著治療作用[15]。藥效學研究顯示,芥子咳喘貼具有明顯的鎮咳、祛痰作用。在抗炎方面,常規劑量組對部分炎癥介質,如單核細胞趨化蛋白1、白細胞介素-6具有一定程度抑制作用[16]。

本方以白芥子為君藥,主要成分為白芥子苷、芥子堿和脂肪酸等,其藥理成分白芥子苷通過分解產生硫代異氰酸對羥芐酯,為強力皮膚發紅劑,該化學物質經穴位給藥透皮量和穩定透皮速率較高,且藥物經穴位的透過量穩態透皮速率更高,穴位皮膚滯留量顯著高于非穴位皮膚[17-18]。是促進全方經皮吸收、提高療效的重要保證[19]。硫代異氰酸對羥芐酯對皮膚刺激作用的層次不同,超劑量或皮膚給藥時間過長可造成皮膚刺激損傷或過敏反應[20]。

急毒結果顯示,芥子咳喘貼對日本大耳白兔一般狀況無顯著影響,給藥期間及停藥后,各組日本大耳白兔生理發育、機體代謝及行為活動等各項指標正常。高劑量組對日本大耳白兔肝臟、肺臟、左右腎臟質量和臟器系數有一定影響,表現為肺臟質量增加,肝臟、左右腎臟質量和臟器系數減少,但各組血生化指標并未出現顯著差異,說明芥子咳喘貼高劑量對某些臟器發育具有一定抑制作用,但短期給藥未出現臟器功能損害。

皮膚過敏試驗結果顯示,芥子咳喘貼對Hartley豚鼠無明顯過敏反應;單次給藥完整皮膚試驗結果顯示,芥子咳喘貼對日本大耳白兔無明顯皮膚刺激反應。多次給藥完整皮膚試驗結果顯示,從第4天起,部分日本大耳白兔皮膚出現紅斑及水腫,停藥3 d后皮損逐漸減輕;表明芥子咳喘貼多次給藥對日本大耳白兔皮膚具有一定刺激性,考慮到動物與人體皮膚結構不同,藥物透皮吸收速率不同,故經人體皮膚給藥后出現皮損的時間、程度以及預后可能與本試驗結果有所差異,提示臨床如需要多次給藥,應合理安排給藥間隔時間,以連續給藥不超過3 d為宜,避免皮膚刺激發生。

本研究表明芥子咳喘貼是一種安全性較高的外用貼劑,預期臨床應用安全性良好,上述結果可為臨床推廣提供可資借鑒的參考依據。不足的是,本研究并未進行藥物長期毒性試驗,難以全面評估藥物對重要臟器是否具有遠期損傷以及評估毒性反應劑量。課題組將在下階段組方優化中進一步完善相關研究。

利益沖突聲明:所有作者聲明不存在利益沖突關系。