花鱸半乳糖凝集素基因家族的鑒定及在不同環(huán)境因子脅迫下表達(dá)響應(yīng)?

鄭 圓, 溫海深, 李吉方, 方 秀, 王靈鈺 ,張 沖, 陶澤鑫, 張永航, 李 昀??

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué)), 山東 青島 266003; 2. 福建省花鱸育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 福鼎 355200)

凝集素(Lectin)是一類具有廣泛生物學(xué)功能的碳水化合物結(jié)合蛋白,在病毒、細(xì)菌和動(dòng)植物中均廣泛分布,其介導(dǎo)的蛋白質(zhì)-碳水化合物間的相互作用在先天免疫如病原體識(shí)別中扮演著重要角色[1-3]。半乳糖凝集素(Galectins)是凝集素超家族中的一個(gè)較為保守的β-半乳糖苷結(jié)合蛋白家族,其特點(diǎn)為具有一個(gè)保守、可特異性識(shí)別β-半乳糖苷的碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域(Carbohydrate-recognition domain,CRD),但缺少信號(hào)肽,是一類非經(jīng)典的分泌型蛋白質(zhì)[4]。根據(jù)CRD 的結(jié)構(gòu)和數(shù)量特征,人的Galectins可劃分為三種類型:原型(Prototype),僅含一個(gè)CRD,多以單體或同型二聚體的形式存在,包括Galectin-1(LGALS1)、Galectin-2(LGALS2)、Galectin-5(LGALS5)、Galectin-7(LGALS7)、Galectin-10(LGALS10)、Galectin-11(LGALS11)、Galectin-13(LGALS13)、Galectin-14(LGALS14)、Galectin-15(LGALS15)、Galectin-16(LGALS16)、Galectin-17(LGALS17)以及Galectin-related protein(GRP)[5-7];串聯(lián)重復(fù)型(Tandem repeat-type),為單體凝集素,通過(guò)短鏈多肽連接兩個(gè)CRD,包括Galectin-4(LGALS4)、Galectin-6(LGALS6)、Galectin-8(LGALS8)、Galectin-9(LGALS9)和Galectin-12(LGALS12);嵌合型(Chimeric type),同為單體凝集素,在N-末端具有富含脯氨酸和甘氨酸的結(jié)構(gòu)域,在C-末端含有CRD,其連接到一個(gè)非凝集素氨基末端區(qū)域,可形成五聚體結(jié)構(gòu),僅包括Galectin-3(LGALS3)[8]。

諸多研究表明Galectins可參與多種生物學(xué)過(guò)程,如癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲與轉(zhuǎn)移[9],炎癥和免疫反應(yīng)[10],以及個(gè)體發(fā)育等[11]。在哺乳動(dòng)物中,Galectins廣泛分布于免疫器官和免疫細(xì)胞中,參與免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生[12]。近年來(lái),越來(lái)越來(lái)多的研究表明水生生物中Galectins可作為抗菌和非自我識(shí)別分子在先天性免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13]。例如,在斑馬魚(yú)(Daniorerio)中,當(dāng)傳染性造血器官壞死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)感染時(shí),可在細(xì)胞外觀察到Galectins以碳水化合物結(jié)合的方式直接與上皮細(xì)胞表面的IHNV的糖基化包膜和多糖相互作用,從而顯著降低病毒的粘附[14]。當(dāng)尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)感染無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)5 d后,LGALS8在脾臟中的表達(dá)顯著上調(diào),表明其參與了抗細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)[15]。條石鯛(Oplegnathusfasciatus)的重組蛋白Gal2具有血凝性,對(duì)乳糖和半乳糖表現(xiàn)出親和力,可凝集和結(jié)合潛在致病菌和纖毛蟲(chóng),增強(qiáng)免疫能力[16]。

此外,Galectins在響應(yīng)環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要作用,被認(rèn)為是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的生物標(biāo)志物[17]。例如,在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中,證明了小鼠LGALS3在缺氧和營(yíng)養(yǎng)匱乏的微環(huán)境應(yīng)激中可通過(guò)上調(diào)表達(dá)來(lái)提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活能力[18]。在氧化脅迫(30% H2O2,37 ℃培養(yǎng)16 h)下,管圓線蟲(chóng)(Angiostrongyluscantonensis)的LGALS10的表達(dá)水平顯著增加,且體外原核表達(dá)的管圓線蟲(chóng)GAL10蛋白可在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系中激活其小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)響應(yīng)氧化脅迫[19]。通過(guò)RNA干擾技術(shù)來(lái)沉默中華蜜蜂(Apisceranacerana)LGALS1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激下相關(guān)抗氧化基因出現(xiàn)顯著差異表達(dá),表明LGALS1參與了氧化應(yīng)激響應(yīng),能夠提高抗氧化損傷的抵抗力[20]。魚(yú)類作為生活在水環(huán)境中的低等脊椎動(dòng)物,易遭受多種類型的環(huán)境因子脅迫,養(yǎng)殖過(guò)程中常見(jiàn)的有溫度、鹽堿度、溶解氧等[21]。脅迫會(huì)打破個(gè)體與環(huán)境間的平衡狀態(tài),導(dǎo)致魚(yú)體生理機(jī)能紊亂,免疫防御能力下降,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[22]。因此,研究Galectins對(duì)于提高機(jī)體免疫能力和解析環(huán)境脅迫應(yīng)答機(jī)制具有重要意義。自從在電鰻(Electrophoruselectricus)的發(fā)電器官中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)硬骨魚(yú)的半乳糖凝集素-電凝集素(Electrolectin)以來(lái)[23],Galectins在許多魚(yú)類中被鑒定出來(lái)。到目前為止,分別在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、斑點(diǎn)叉尾鮰(IctalurusPunctatus)和紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)中完成了對(duì)Galectin基因家族的鑒定[24-26],然而這些研究多集中于該家族在免疫應(yīng)答功能方面的研究,對(duì)其在響應(yīng)環(huán)境因子脅迫中的功能機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。

花鱸(Lateolabraxmaculatus)又稱中國(guó)花鱸,俗稱海鱸、寨花、七星鱸等,隸屬于鱸形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)花鱸屬(Lateolabrax)。其廣泛分布于中國(guó)、越南與韓國(guó)沿海地區(qū),具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、口感好的特點(diǎn),是中國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量高的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一[27-28]。隨著近年來(lái)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,花鱸養(yǎng)殖被愈來(lái)愈多的環(huán)境因素所制約,嚴(yán)重影響了其養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。本研究對(duì)花鱸Galectin基因家族進(jìn)行了全基因組水平的系統(tǒng)鑒定,并開(kāi)展了拷貝數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育、共線性及基因結(jié)構(gòu)特征等分析。此外,利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)繪制了花鱸Galectin基因家族的組織表達(dá)圖譜,并分析了其在低氧、鹽度、堿度及高溫脅迫下的基因表達(dá)特征。本研究結(jié)果為闡明在多種環(huán)境因子脅迫下花鱸Galectins的功能機(jī)制提供理論基礎(chǔ),并為花鱸抗逆性狀的良種選育工作的開(kāi)展提供了候選分子。

1 材料與方法

1.1 花鱸Galectin基因的全基因組鑒定和序列分析

從NCBI(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索下載人(Homosapiens)、斑馬魚(yú)和尼羅羅非魚(yú)Galectin家族全部成員的氨基酸序列,通過(guò)TBtools軟件的TBLASTN(1×10-5)方法對(duì)花鱸全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(PRJNA408177)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(SRR4409341和SRR4409397)進(jìn)行比對(duì),初步獲得花鱸候選Galectin基因的核苷酸序列。通過(guò)ORF Finder(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)工具對(duì)花鱸候選Galectin的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè),在NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(NR)中通過(guò)BLASTP工具對(duì)獲得的預(yù)測(cè)序列進(jìn)行確認(rèn)。此外,利用ExPASy Prot-Param(https: //web.expasy.org/protparam/)工具預(yù)測(cè)Galectin蛋白的分子量(Molecular Weight, MW)和理論等電點(diǎn)(isoelectric point, pI),通過(guò)DTU Health Tech(https: //www.healthtech.dtu.dk/english)中的NetPhos-3.1工具對(duì)Galectin蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2 花鱸Galectin基因系統(tǒng)發(fā)育和同源性分析

為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索下載人、小鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、牛(Bostaurus)、斑馬魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)、大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)、大西洋鱈魚(yú)(Gadusmorhua)、紅鰭東方鲀和斑點(diǎn)叉尾鮰的Galectin氨基酸序列。通過(guò)MEGA11.0軟件(https: //www.megasoftware.net/)中ClustalW算法(默認(rèn)參數(shù))進(jìn)行多重序列比對(duì),運(yùn)用Neighbor-Joining(NJ)法和Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),每個(gè)分支上的bootstrap值重復(fù)1 000次[29]。利用在線網(wǎng)站ITOL(http: //itol.embl.de/)對(duì)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行可視化。

通過(guò)共線性分析來(lái)進(jìn)一步確定基因的同源性。使用多重共線性掃描工具包(MCScanX)的默認(rèn)參數(shù)[30]分析花鱸與斑馬魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)物種間的共線性關(guān)系,利用Circos[31]對(duì)花鱸基因組內(nèi)的共線性基因進(jìn)行可視化,并將Galectin基因定位到花鱸染色體上。斑馬魚(yú)(GRCz11)和尼羅羅非魚(yú)(UMD_NMBU)參考基因組數(shù)據(jù)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載,物種間的共線性分析通過(guò)Multiple Synteny Plot工具進(jìn)行(https: //github.com/CJ-Chen/TBtools)。

1.3 花鱸Galectin基因的基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

通過(guò)NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)預(yù)測(cè)花鱸Galectin蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。利用在線網(wǎng)站MEME(https: //meme-suite.org/meme/tools/meme)對(duì)花鱸Galectin蛋白的保守基序(Motif)進(jìn)行分析。將上述所獲結(jié)果通過(guò)TBtools軟件進(jìn)行可視化[32]。

1.4 花鱸Galectin基因的組織表達(dá)譜分析

為探究花鱸Galectin基因在不同組織中的表達(dá)模式,從NCBI中下載1齡花鱸7個(gè)組織的RNA-seq數(shù)據(jù)集(肝-SRR7528886、鰓-SRR7528883、脾-SRR752888、胃-SRR7528884、腦-SRR7528887、精巢-SRR7528885、卵巢-SRR2937376)。下載原始測(cè)序數(shù)據(jù)(Raw data)后,通過(guò)FastQC v0.11.9軟件進(jìn)行質(zhì)檢(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/),利用trimmomatic v0.39對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾,去除接頭和低質(zhì)量序列,獲得高質(zhì)量clean reads[33]。使用Hisat2 v2.2.1的默認(rèn)參數(shù)[34]將clean reads比對(duì)到花鱸參考基因組(PRJNA407434)中,利用samtools 1.6進(jìn)行排序[35],通過(guò)StringTie v2.1.7進(jìn)行基因表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化,結(jié)果以FPKM(Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)的形式表示[36]。取log2(FPKM+1),通過(guò)TBtools軟件繪制Galectin基因的表達(dá)量熱圖。

1.5 環(huán)境因子脅迫試驗(yàn)

為探究花鱸Galectin基因在不同環(huán)境因子脅迫下的表達(dá)特征,對(duì)已有的4個(gè)環(huán)境脅迫試驗(yàn):低氧、鹽度、堿度及高溫脅迫處理后測(cè)得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因表達(dá)模式分析。脅迫試驗(yàn)流程如下文所示。

1.5.1 低氧脅迫試驗(yàn) 試驗(yàn)前將60尾花鱸(體質(zhì)量為(178.25±18.56) g,體長(zhǎng)為(48.76±4.26) cm)進(jìn)行2周暫養(yǎng)(溶解氧為(6.89±0.25) mg/L)。試驗(yàn)開(kāi)始前30 min向3個(gè)400 L平行圓桶連續(xù)快速注入氮?dú)饨档腿苎趿?當(dāng)溶氧量下降并穩(wěn)定在預(yù)實(shí)驗(yàn)所獲臨界值(1.10±0.14) mg/L(溶氧儀YSI DO200)時(shí),將花鱸迅速轉(zhuǎn)移至3個(gè)圓桶內(nèi)(每桶隨機(jī)均分20尾)進(jìn)行低氧脅迫試驗(yàn)。試驗(yàn)過(guò)程中,通過(guò)氣石輸入空氣,使花鱸呼吸消耗的氧氣與通入的空氣維持平衡,保持溶解氧相對(duì)穩(wěn)定。于脅迫前(0 h)及脅迫后3、6和12 h共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)選取9尾花鱸采集鰓組織樣品(每個(gè)平行圓桶隨機(jī)采集3尾)。

1.5.2 鹽度脅迫試驗(yàn) 試驗(yàn)前將108尾花鱸(體質(zhì)量為(127.35±15.31) g)隨機(jī)均分于9個(gè)120 L平行方桶進(jìn)行一周鹽度馴化(鹽度為30)。暫養(yǎng)結(jié)束后將其中3個(gè)方桶鹽度于12 h內(nèi)逐漸調(diào)整至0(設(shè)為淡水FW組),3個(gè)方桶鹽度調(diào)至12(設(shè)為半咸水BW組),剩余3個(gè)方桶鹽度保持30(設(shè)為海水SW組)。試驗(yàn)周期為30 d,期間其余試驗(yàn)條件保持不變,每日喂食一次。養(yǎng)殖結(jié)束后每組各取18尾魚(yú)的鰓組織樣品(每個(gè)平行方桶各隨機(jī)采集6尾)。

1.5.3 堿度脅迫試驗(yàn) 試驗(yàn)前將36尾1齡花鱸(體質(zhì)量為(140.32±2.56) g)進(jìn)行2周暫養(yǎng),然后立即將其轉(zhuǎn)移到3個(gè)400 L裝有堿度水體的平行圓桶(碳酸鹽濃度為(18.0±0.2) mmol/L,pH=9.0±0.2)進(jìn)行急性堿度脅迫試驗(yàn)。堿度水體由NaHCO3(12.8 mmol/L)和Na2CO3(2.6 mmol/L)配制而成,在試驗(yàn)前對(duì)水體進(jìn)行24 h曝氣處理。于脅迫前(0 h)及脅迫后12、24和72 h共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各采集9尾魚(yú)的鰓組織樣品(每個(gè)平行圓桶各隨機(jī)采集3尾)。

1.5.4 高溫脅迫試驗(yàn) 試驗(yàn)前將60尾花鱸(體質(zhì)量為(38.96±2.01) g,體長(zhǎng)為(13.33±0.24) cm)隨機(jī)均分于3個(gè)120 L平行方桶中進(jìn)行2周暫養(yǎng)。試驗(yàn)開(kāi)始前3個(gè)平行方桶水溫為25 ℃,隨后以1 ℃/h升溫速率升至目標(biāo)溫度32 ℃并保持至試驗(yàn)結(jié)束。分別于0 h(升溫前)、10 h (熱應(yīng)激后3 h)、13 h (熱應(yīng)激后6 h)、19 h(熱應(yīng)激后12 h)以及31 h(熱應(yīng)激后24 h)共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)各采集9尾魚(yú)的肝組織樣品(每個(gè)方桶內(nèi)各隨機(jī)采集3尾)。

1.6 花鱸Galectin基因在環(huán)境因子脅迫下的表達(dá)模式分析

采用TRIZOL法(Invitrogen,美國(guó))對(duì)以上樣品總RNA進(jìn)行提取,并用NanoDrop 2000核酸定量?jī)x(Thermo Scientific,美國(guó))和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。質(zhì)檢合格后,低氧脅迫試驗(yàn)中將來(lái)自同一圓桶的3 尾魚(yú)的 RNA 樣本進(jìn)行等質(zhì)量混合,共構(gòu)建12個(gè)測(cè)序文庫(kù)(4個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)×3個(gè)重復(fù)),利用Illumina HiSeq 4000測(cè)序平臺(tái)對(duì)各文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序(PRJNA408177);鹽度脅迫試驗(yàn)中將來(lái)自同一方桶的3 尾魚(yú)的 RNA 樣本進(jìn)行等質(zhì)量混合,共構(gòu)建9個(gè)測(cè)序文庫(kù)(3個(gè)試驗(yàn)組×3個(gè)重復(fù)),利用Illumina NovaseqTM6000測(cè)序平臺(tái)對(duì)各文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序(PRJNA515986);堿度脅迫試驗(yàn)中將來(lái)自同一圓桶的3 尾魚(yú)的 RNA 樣本進(jìn)行等質(zhì)量混合,共構(gòu)建12個(gè)測(cè)序文庫(kù)(4個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)×3個(gè)重復(fù)),利用Illumina HiSeq X Ten 測(cè)序平臺(tái)對(duì)各文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序(PRJNA611641);高溫脅迫試驗(yàn)中將來(lái)自同一方桶的3尾魚(yú)的RNA樣本進(jìn)行等質(zhì)量混合,共構(gòu)建15個(gè)測(cè)序文庫(kù)(5個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)×3個(gè)重復(fù)),利用Illumina NovaseqTM6000測(cè)序平臺(tái)對(duì)各文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

下載原始測(cè)序數(shù)據(jù)后,參考1.4中RNA-seq數(shù)據(jù)分析流程,得到花鱸特定組織在4種不同環(huán)境因子脅迫下Galectin基因的FPKM值。其中在clean reads比對(duì)到花鱸參考基因組后,使用featurecount v2.0.1統(tǒng)計(jì)基因reads數(shù)[37],隨后將原始計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)(Raw counts data)導(dǎo)入DESeq2 v1.30.1(http: //www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)進(jìn)行差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05表示差異顯著。取log2(FPKM+1),通過(guò)TBtools軟件展示Galectin基因的聚類表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花鱸Galectin基因鑒定及序列分析

本研究在花鱸基因組中共鑒定出14個(gè)Galectin基因,根據(jù)現(xiàn)有的分類方式進(jìn)一步分為3類(見(jiàn)表1):(1)原型,包括LGALS1、LGALS2a、LGALS2b、LGALS17、GRPa、GRPb和GRPc;(2)串聯(lián)重復(fù)型,包括LGALS4、LGALS8a、LGALS8b和LGALS9;(3)嵌合型,包括LGALS3a、LGALS3ba和LGALS3bb。各Galectin基因序列的ORF長(zhǎng)度范圍為396～1221 bp,編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目為131～406,預(yù)測(cè)分子量為15.90～44.86 kDa,等電點(diǎn)為4.69～9.69,磷酸化位點(diǎn)個(gè)數(shù)為8～41。以上基因信息及Genbank序列號(hào)在表1中列出。

表1 花鱸Galectin基因家族成員的序列特征Table1 Summary ofsequence characteristics of Galectin gene family members in spotted sea bass

2.2 花鱸Galectin基因系統(tǒng)發(fā)育分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證花鱸Galectin基因注釋的準(zhǔn)確性,選取人、鼠、雞、牛、斑馬魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)、大黃魚(yú)、大西洋鱈魚(yú)、紅旗東方鲀、斑點(diǎn)叉尾鮰以及花鱸Galectin氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖1所示,根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,Galectin基因可聚為8個(gè)分支,分別為L(zhǎng)GALS1、LGALS2、LGALS3、LGALS4、LGALS8、LGALS9、LGALS17和GRP。其中硬骨魚(yú)同種Galectin基因聚為一枝,后與其他高等脊椎動(dòng)物的相應(yīng)基因共聚為一枝。花鱸Galectin基因與在分類地位上親緣關(guān)系較近的硬骨魚(yú)聚為一枝,聚類效果良好(見(jiàn)圖1)。

(分支節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字表示bootstrapping值,紅色圓圈表示花鱸Galectin基因,不同顏色圓環(huán)表示Galectin基因不同的亞家族。Numbers on node denote the bootstrapping values, red circles denote Galectin genes of spotted sea bass, and different colored rings denote different subfamilies of Galectin genes.)圖1 Galectin基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of Galectin genes

2.3 花鱸Galectin基因拷貝數(shù)分析

對(duì)Galectin基因在人、小鼠、雞、牛、斑馬魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)、大黃魚(yú)、大西洋鱈魚(yú)、紅鰭東方鲀、斑點(diǎn)叉尾鮰和花鱸共11種脊椎動(dòng)物中的拷貝數(shù)進(jìn)行了比較(見(jiàn)表2)。結(jié)果顯示,不同物種的Galectin基因數(shù)量從8到16不等。具體而言,人和斑馬魚(yú)有16個(gè)Galectin基因,為檢測(cè)物種中數(shù)量最多,雞的數(shù)量最少,只有8個(gè)。LGALS7和LGALS12為哺乳動(dòng)物所特有。在硬骨魚(yú)中,均含有2個(gè)LGALS8基因和3個(gè)GRP基因,而高等脊椎動(dòng)物中均各只含一個(gè)。此外,LGALS2、LGALS3在硬骨魚(yú)的基因組也普遍存在多拷貝現(xiàn)象,而高等脊椎動(dòng)物僅含有一個(gè)基因拷貝。值得一提的是,尼羅羅非魚(yú)的Galectin基因數(shù)量與本研究中花鱸鑒定得到的相同,這也印證了兩個(gè)物種在分類地位上的相近。

表2 幾種代表性脊椎動(dòng)物中Galectin基因的拷貝數(shù)Table 2 Copy numbers of Galectin genes among several representative vertebrate species

2.4 花鱸Galectin基因染色體分布及共線性分析

通過(guò)Circos對(duì)花鱸Galectin基因在染色體上的分布進(jìn)行展示。如圖2所示,花鱸的Galectin基因分別分布于chr1、chr3、chr10、chr11、chr17、chr22、chr24和未能掛載在染色體的scaffold_158上。其中,chr22上含有3個(gè)Galectin基因:LGALS3ba、LGALS8b和GRPb,是所有染色體中最多的。chr1、chr3、chr10和chr17均包含2個(gè)Galectin基因,chr11、chr24和scaffold_158僅含1個(gè)Galectin基因。

(灰線表示花鱸基因組的共線性區(qū)塊,藍(lán)色方塊表示花鱸染色體,外環(huán)表示基因密度。圖示的標(biāo)尺中“0～14”表示基因組中基因數(shù)量與基因組長(zhǎng)度的比值。 The gray line denotes the genome collinearity block of spotted sea bass, the blue square denotes the chromosome of spotted sea bass, and the outer ring denotes the gene density. The ratio of gene number to genome length is presented by “0～14” of scale legend.)圖2 花鱸Galectin基因的染色體分布和共線性關(guān)系Fig.2 Chromosomal distribution and homologous relationships of Galectin genes in spotted sea bass

如圖3所示,在尼羅羅非魚(yú)與花鱸的共線性分析中,共得到22個(gè)尼羅羅非魚(yú)和花鱸的Galectin基因有直系同源關(guān)系的共線性區(qū)塊,分別位于尼羅羅非魚(yú)的chr4、chr6、chr13、chr14、chr15和chr19以及花鱸的chr1、chr3、chr10、chr11、chr17和chr22染色體上。而在斑馬魚(yú)與花鱸的共線性分析中,共得到11個(gè)斑馬魚(yú)和花鱸的Galectin基因有直系同源關(guān)系的共線性區(qū)塊,分別位于斑馬魚(yú)的chr1、chr3、chr6、chr13、chr15和chr17以及花鱸的chr1、chr3和chr22染色體上。

(灰線表示物種間的共線性區(qū)塊,黑線表示花鱸Galectin基因的共線性區(qū)塊,不同顏色方塊表示不同物種的染色體。The gray lines denote the collinearity block between species, the black lines denote the collinearity block of spotted sea bass Galectin genes, and different colored ring squares denote the chromosomes of different species.)圖3 尼羅羅非魚(yú)、斑馬魚(yú)和花鱸Galectin基因的共線性分析Fig.3 Synteny analysis of Galectin genes among Nile tilapia, zebrafish and spotted sea bass

2.5 花鱸Galectin基因結(jié)構(gòu)分析

圖4對(duì)花鱸Galectin基因的預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域(Domain)和保守基序(Motif)進(jìn)行可視化。利用CDD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到6種類型的保守結(jié)構(gòu)域,包括GLECT、Gal-bind_lectin、PRK07764超家族、Ig超家族、IG_like和Cytadhesin_P30超家族結(jié)構(gòu)域。其中GLECT結(jié)構(gòu)域在LGALS1、LGALS2b和LGALS9中預(yù)測(cè)獲得;LGALS2a、LGALS3a、LGALS3ba、LGALS3bb、LGALS4、LGALS8a、LGALS8b、LGALS9、GRPa、GRPb和GRPc含有Gal-bind_lectin結(jié)構(gòu)域;僅LGALS17預(yù)測(cè)出Ig超家族和IG_like結(jié)構(gòu)域;PRK07764超家族和Cytadhesin_P30超家族結(jié)構(gòu)域分別在LGALS3bb和LGALS9中預(yù)測(cè)獲得。通過(guò)MEME數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)共獲得7個(gè)Motif,其中LGALS1、LGALS2a和LGALS2b均含有Motif 2、3、4、5;LGALS3a、LGALS3ba、LGALS3bb、GRPa、GRPb和GRPc均含有Motif1、2、3、4;而LGALS4、LGALS8a、LGALS8b和LGALS9都含有這7個(gè)Motif(見(jiàn)圖4)。

圖4 花鱸Galecitn基因結(jié)構(gòu)可視化分析Fig.4 Visualization analysis of Galectin genes structure of spotted sea bass

2.6 花鱸Galectin基因組織表達(dá)分析

本研究對(duì)花鱸(1齡)7個(gè)成體組織(肝、鰓、脾、胃、腦、精巢和卵巢)中Galectin基因的表達(dá)量進(jìn)行了聚類分析(見(jiàn)圖5)。如圖5所示,LGALS8a、LGALS9和LGALS17在7個(gè)組織中廣泛表達(dá),且在鰓、脾、胃、肝臟和精巢中均呈現(xiàn)高表達(dá),且LGALS9和LGALS17在脾中表達(dá)最高,鰓中次之。除此之外,LGLS3ba在鰓中表達(dá)量最高,胃和脾中次之,LGALS4僅在胃中高表達(dá),GRPa僅在脾和腦中表達(dá)較高,而其余Galectin基因在上述7個(gè)組織中表達(dá)量較低。

(圖示的標(biāo)尺中“0～10”表示log2(FPKM+1)值。The value of log2(FPKM+1) is presented by “0～10” of scale legend.)圖5 花鱸Galectin基因的組織表達(dá)模式Fig.5 Expression patterns of Galectin genes in different tissues of spotted sea bass

2.7 花鱸Galectin基因在多種環(huán)境因子脅迫下的表達(dá)分析

為研究花鱸Galectin基因在多種環(huán)境脅迫下的表達(dá)模式,對(duì)多個(gè)脅迫試驗(yàn)的特定組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果表明,在低氧脅迫下的花鱸鰓組織中LGALS3a、LGALS17、GRPb和GRPc顯著差異表達(dá)。

其中,LGALS17的表達(dá)量呈短暫降低的趨勢(shì),且在3 h時(shí)顯著降低(為0 h的62%),并在12 h恢復(fù)到了0 h的水平;LGALS3a、GRPb和GRPc的表達(dá)量呈短暫升高的趨勢(shì),LGALS3a在6 h時(shí)表達(dá)量顯著升高(為0 h的1.11倍),并在12 h恢復(fù)到了0 h的水平;GRPb在12 h時(shí)表達(dá)量顯著升高(為0 h的1.71倍);GRPc在3和6 h時(shí)表達(dá)量顯著升高(分別為0 h的1.34和1.50倍)。而LGALS1、LGALS2a、LGALS2b、LGALS3bb、LGALS4、LGALS8b和GRPa在整個(gè)過(guò)程中一直保持較低的表達(dá)水平 (FPKM值在各時(shí)間點(diǎn)均小于10且無(wú)顯著差異);LGALS3ba、LGALS8a和LGALS9雖然表達(dá)水平較高(FPKM值在各時(shí)間點(diǎn)均大于70),但在各時(shí)間點(diǎn)間不存在顯著差異(見(jiàn)圖6A)。

(A:低氧脅迫下鰓中的表達(dá)模式;B:不同鹽度脅迫下鰓中的表達(dá)模式;C:堿度脅迫下鰓中的表達(dá)模式;D:高溫脅迫下肝中的表達(dá)模式。圖示的標(biāo)尺表示log2(FPKM+1)值; 表示顯著差異(P<0.05)。A: Expression patterns of gill under hypoxia stress; B: Expression patterns of gill under different salinity stresses; C: Expression patterns of gill under alkalinity stress; D: Expression patterns of liver under heat stress. The value of log2(FPKM+1) is presented by the scale legend; denotes the significant differences (P<0.05).)圖6 花鱸Galectin基因在多種環(huán)境脅迫下的表達(dá)模式Fig.6 Expression patterns of Galectin genes in spotted sea bass under various environmental stresses

在不同鹽度環(huán)境下的花鱸鰓組織中,相較于海水組(SW),半咸水組(BW)中的LGALS4表達(dá)量顯著升高(為SW組的1.61倍),淡水組(FW)的LGALS4表達(dá)量顯著降低(為SW組的60%),而LGALS3a、LGALS3ba、GRPb和GPRc的表達(dá)量顯著升高(分別為SW組的1.22、1.17、1.31和1.35倍)。LGALS2a和LGALS3bb幾乎檢測(cè)不到表達(dá)(FPKM<1),而LGALS1、LGALS2b、LGALS8a、LGALS8b、LGALS9、LGALS17和GRPa表達(dá)水平在各鹽度組并未出現(xiàn)明顯差異(見(jiàn)圖6B)。

在堿度脅迫下的花鱸鰓組織中,LGALS17和GRPa的表達(dá)量在整個(gè)脅迫過(guò)程中顯著升高,并在72 h仍處于持續(xù)升高的狀態(tài)。其中GRPa的上調(diào)程度最顯著,72 h表達(dá)量為0 h的4.42倍。LGALS2b在12 h時(shí)的表達(dá)量呈短暫升高的趨勢(shì)(為0 h的2.47倍),并在24 h恢復(fù)到初始水平。LGALS3ba和LGALS4的表達(dá)量則在整個(gè)脅迫過(guò)程中均處于顯著降低的狀態(tài)。其中LGALS4的降低程度最顯著,72 h表達(dá)量為0 h的34%。除此之外,GRPb和LGALS8a在72 h時(shí)才表現(xiàn)出表達(dá)量的顯著改變(分別升高為0 h的1.37倍和降低為0 h的88%,見(jiàn)圖6C)。

在高溫脅迫下的花鱸肝臟組織中,LGALS8b、LGALS17以及GRPb的表達(dá)量在整個(gè)脅迫過(guò)程中顯著降低,且在24 h時(shí)仍處于顯著降低的狀態(tài)。而LGALS8b降低程度最顯著,在12 h時(shí)降低為0 h的5%。LGALS2a、LGALS3a、LGALS3ba、LGALS4和GRPa的表達(dá)量在脅迫過(guò)程中呈短暫升高的趨勢(shì)。其中,LGALS3a分別在3和12 h發(fā)生顯著升高(分別為0 h的1.38和3.31倍);LGALS3ba和LGALS4在6 h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)(分別為0 h的20.5和8.5倍),且在24 h恢復(fù)到了0 h的水平;LGALS2a分別在12和24 h發(fā)生顯著升高(分別為0 h的1.65和3.71倍);GRPa則在24 h發(fā)生顯著升高(為0 h的1.41倍)。LGALS1和LGALS9則恰好相反,在脅迫過(guò)程中出現(xiàn)了短暫的降低趨勢(shì),均在3 h達(dá)到最低點(diǎn)(分別為0 h的29%和39%),并在24 h恢復(fù)到0 h的水平。此外,LGALS8a的表達(dá)量呈先降低后升高趨勢(shì),其中3 h的表達(dá)量顯著降低(為0 h的69%),而12 h的表達(dá)量顯著升高(為0 h的1.69倍)。LGALS2b,LGALS3bb和GRPc在整個(gè)高溫脅迫過(guò)程中幾乎檢測(cè)不到表達(dá)(FPKM<1)(見(jiàn)圖6D)。

3 討論

Galectins是一個(gè)較為保守的β-半乳糖苷結(jié)合蛋白的凝集素家族,從真菌到脊椎動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)[38]。然而,大多數(shù)的基因都是通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析來(lái)進(jìn)行注釋的,這使得許多基因的命名變得混亂,尤其是在Galectin家族的鑒定中[24]。例如,在斑馬魚(yú)中三個(gè)LGALS3基因都帶有類似Galectin-3-like的注釋,這使得進(jìn)一步的基因功能分析變得十分困難[13]。本研究在花鱸中對(duì)Galectin基因家族進(jìn)行完整的系統(tǒng)鑒定,為闡明Galectins在響應(yīng)環(huán)境脅迫過(guò)程中的功能機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

本研究共鑒定了14個(gè)Galectin基因,系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果驗(yàn)證了基因注釋的準(zhǔn)確性(見(jiàn)圖1)。此外,拷貝數(shù)分析結(jié)果表明,花鱸Galectin基因數(shù)量與分類地位較近的尼羅羅非魚(yú)相同,且與其他硬骨魚(yú)類相近(見(jiàn)表2)。同時(shí)在硬骨魚(yú)中,LGALS2、LGALS8和GRP數(shù)量一致。除此之外,Galectin的多拷貝基因并不是串聯(lián)重復(fù)排列,而是分布在不同的染色體上(見(jiàn)圖2),這表明花鱸中Galectin基因的多拷貝現(xiàn)象可能是由于硬骨魚(yú)中額外的全基因組復(fù)制(Whole genome duplications, WGD)事件產(chǎn)生的[39]。共線性分析中,花鱸Galectin基因與尼羅羅非魚(yú)、斑馬魚(yú)具有良好的直系同源關(guān)系(見(jiàn)圖4):22個(gè)尼羅羅非魚(yú)和花鱸Galectin基因共線性區(qū)塊、11個(gè)斑馬魚(yú)和花鱸Galectin基因共線性區(qū)塊,這進(jìn)一步說(shuō)明了其基因注釋的正確和結(jié)構(gòu)上的保守。

Galectins廣泛存在于大多數(shù)生物體中[40],能識(shí)別病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)表面的碳水化合物[41-42]。本研究中,組織表達(dá)模式分析顯示14個(gè)Galectin基因在花鱸7個(gè)組織(肝、鰓、脾、胃、腦、精巢和卵巢)中廣泛表達(dá)。Galectin基因這種廣泛的組織表達(dá)分布在其他魚(yú)類中也有發(fā)現(xiàn)。比如,大菱鲆中13個(gè)Galectin基因在腦、皮膚、腸、鰓、肝、脾、血以及頭腎中均有表達(dá)[24]。在斑點(diǎn)叉尾鮰中,12個(gè)Galectin基因廣泛表達(dá)于腦、體腎、肌肉、腸、頭腎、脾、肝、鰓和皮膚中[25]。紅鰭東方鲀中12個(gè)Galectin基因在腦、腎、心臟、皮膚、鰓、肌肉、脾、腸和肝中均有表達(dá)[26]。同時(shí),LGALS3ba、LGALS8a、LGALS9和LGALS17在花鱸脾臟中高表達(dá),而脾臟為魚(yú)類的主要免疫器官,表明這些基因可能在花鱸免疫應(yīng)答時(shí)發(fā)揮著重要作用。而LGALS3、LGALS8和LGALS9的免疫功能在草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)、尼羅羅非魚(yú)和鱖(Sinipercachuatsi)等硬骨魚(yú)中也得到了驗(yàn)證[15,43-44]。

魚(yú)類對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)大致分為三個(gè)階段[45-46]:初級(jí)階段(如神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)和皮質(zhì)類固醇-兒茶酚胺釋放),次級(jí)階段(如代謝、細(xì)胞、血液和免疫反應(yīng))和三級(jí)階段(整個(gè)生物體的生理和行為應(yīng)激反應(yīng))。Galectin家族是在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的一個(gè)家族,本文針對(duì)其在花鱸響應(yīng)環(huán)境因子脅迫的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。LGALS17的表達(dá)水平在短期脅迫(高溫、低氧和堿度)中均發(fā)生顯著變化,且均出現(xiàn)在脅迫12 h之內(nèi)甚至3 h以前,而長(zhǎng)期鹽度試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量變化。在基因結(jié)構(gòu)分析中,對(duì)LGALS17預(yù)測(cè)得到Ig superfamily和IG-like保守結(jié)構(gòu)域。IG作為具有抗體活性的免疫球蛋白,在免疫系統(tǒng)中對(duì)防御致病菌和病毒具有著重要作用[47],推測(cè)LGALS17是在短期脅迫中進(jìn)行快速的免疫應(yīng)答來(lái)完成脅迫響應(yīng)。LGALS4的表達(dá)模式在短期脅迫(高溫和堿度)和長(zhǎng)期鹽度脅迫中存在顯著差異。LGALS4作為串聯(lián)重復(fù)型凝集素,其兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(CRD)可同時(shí)與不同的配體結(jié)合,在許多生物學(xué)過(guò)程中成為關(guān)鍵的交聯(lián)劑和調(diào)節(jié)因子,具有增強(qiáng)脂筏穩(wěn)定性、參與糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、促進(jìn)腸道創(chuàng)傷愈合和促進(jìn)神經(jīng)元軸突發(fā)育及髓鞘形成等生理功能,對(duì)維持生理平衡起著重要作用[48]。推測(cè)LGALS4在短期和長(zhǎng)期脅迫中能通過(guò)維持生理平衡來(lái)進(jìn)行脅迫響應(yīng)。有研究表明LGALS3和GRPb在細(xì)菌感染過(guò)程中可作為細(xì)胞表面的附著點(diǎn)或促進(jìn)粘附的交聯(lián)因子[49-52]。在尼羅羅非魚(yú)中,LGALS3和GRPb可通過(guò)調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞的活性來(lái)完成免疫應(yīng)答[52-53]。本研究中LGALS3a、LGALS3ba和GRPb在短期和長(zhǎng)期脅迫中均差異表達(dá),其可能通過(guò)免疫應(yīng)答來(lái)實(shí)現(xiàn)脅迫響應(yīng)。綜上分析發(fā)現(xiàn),LGALS3a、LGALS3ba、LGALS4、LGALS17和GRPb可能在進(jìn)行環(huán)境因子脅迫的應(yīng)答時(shí)發(fā)揮著潛在作用。在關(guān)于Galectin基因的研究中,也發(fā)現(xiàn)其在響應(yīng)脅迫中扮演著重要角色。比如,小鼠LGALS3可通過(guò)協(xié)調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體來(lái)保證線粒體網(wǎng)絡(luò)形態(tài)的完整性,以啟動(dòng)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)來(lái)提高上皮細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)與防御能力[54]。在鹿角杯形珊瑚(Pocilloporadamicornis)中,LGALS1通過(guò)調(diào)節(jié)病原體與共生藻的識(shí)別來(lái)響應(yīng)高溫脅迫下的珊瑚白化[55]。雖然Galectin基因在環(huán)境因子脅迫下的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明,但其可能以不同的調(diào)控模式在抗逆脅迫中發(fā)揮著潛在作用。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究在花鱸中共鑒定出14個(gè)Galectin基因,通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育、拷貝數(shù)、共線性和基因結(jié)構(gòu)分析驗(yàn)證了基因注釋的準(zhǔn)確性和結(jié)構(gòu)上的保守性。Galectin基因在花鱸多個(gè)組織中廣泛表達(dá),且有6個(gè)基因(LGALS3ba、LGALS4、LGALS8a、LGALS9、LGALS17和GRPa)表現(xiàn)出了組織特異性。在不同環(huán)境因子脅迫中,花鱸Galectin基因在不同組織中的表達(dá)量發(fā)生變化,這表明其參與了脅迫響應(yīng)并發(fā)揮了潛在作用。其中,LGALS3a、LGALS3ba、LGALS4、LGALS17和GRPb變化更顯著、更迅速,其可能在響應(yīng)環(huán)境脅迫中起著更重要的作用。本研究提供了花鱸Galectin基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)信息,為進(jìn)一步研究硬骨魚(yú)中Galectin基因的功能提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。