長牡蠣AMPK基因在三倍體性腺發育中的表達特性及調控機制?

王 朔, 于 紅, 李 琪, 王慶志

(1. 海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學), 山東 青島 266003;2. 遼寧省海洋水產科學研究院 大連市海產貝類種質資源創新利用重點實驗室, 遼寧 大連 116023;3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室, 山東 青島 266237)

貝類養殖是中國海水養殖業的支柱產業之一,牡蠣是貝類養殖業中產量最高的貝類。長牡蠣(Crassostreagigas)也稱太平洋牡蠣,具有繁殖力高、適應能力強、生長迅速、營養豐富等特點,是中國牡蠣養殖的主導品種之一。為解決二倍體牡蠣在夏季因繁殖而出現品質下降的問題,研究者成功誘導出三倍體牡蠣,因其育性差、繁殖季節品質高,彌補了二倍體牡蠣的夏季市場空缺。但三倍體長牡蠣中也存在一定比例的可育個體,Jouaux等[1]根據育性不同將三倍體長牡蠣分為α與β兩種類型,其中α類型性腺中能夠形成較多的生殖細胞并發育至成熟配子,而β類型性腺中生殖細胞數量極少,表現為不育。為何三倍體長牡蠣會出現不同育性?其性腺發育的調控機理是怎樣的?這些問題一直受到研究者的關注。性腺發育伴隨著能量的儲存和利用,開展不同育性三倍體長牡蠣性腺發育的能量轉換調控機制研究,不僅對于揭示長牡蠣三倍體育性的分子調控機制有重要意義,對牡蠣育種中育性控制也具有重要的應用價值。

5′AMP活化蛋白激酶(AMPK)是有機體和細胞內感應能量水平并調節代謝穩態的重要分子,在能量和物質代謝、細胞增殖、凋亡、自噬等生命活動中發揮著重要調控作用[2]。在代謝壓力下AMPK可通過激活ATP產生途徑(脂質氧化、葡萄糖攝取和分解等)和阻斷ATP消耗途徑(糖原、蛋白質和脂肪酸的合成等)調控能量平衡[3]。AMPK是一種異源三聚體,其亞基分別為AMPK α、AMPK β以及AMPK γ,每個亞基都有2個或3個不同的亞型。AMPK在真核生物中具有高度保守的序列結構和功能域[4],其中,AMPK α的蘇氨酸(Thr)172位點已被確定為AMPK激活的決定因素和必需的磷酸化位點[5-7]。AMPK作為一種“能量探測器”參與動物的生殖發育。諸多研究表明AMPK基因在人(Homosapiens)[8]、牛(Bostaurus)[9]、豬(Susscrofa)[10]、嚙齒動物[11-12]、鳥類[13-14]、長牡蠣[15]和秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)[16]等不同物種的生殖系統中表達,并可能在連接性腺軸與能量平衡的生殖功能中發揮關鍵作用。Tosca等[17]研究發現牛卵巢中,AMPK激活降低了卵巢顆粒細胞的生長和蛋白質合成;藥理激活AMPK可阻止豬和牛的卵母細胞減數分裂恢復[18-19]。此外,Kayampilly和Menon觀察到大鼠顆粒細胞暴露于AMPK激活劑后導致細胞周期抑制劑基因p27kip表達增加[20],同時還發現二氫睪酮(DHT)誘導AMPK激活后抑制了顆粒細胞的有絲分裂[21]。

本研究以三倍體長牡蠣為主要研究材料,比較了AMPK三個亞基的mRNA和AMPK α蛋白活性在不同育性長牡蠣雌、雄性腺以及性腺不同發育階段中的表達模式,探究AMPK基因在長牡蠣不同育性三倍體性腺發育能量調控中的作用,旨在為揭示三倍體長牡蠣性腺發育的分子調控機制提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為二齡長牡蠣,三倍體長牡蠣為二、四倍體雜交產生,二倍體長牡蠣為養殖長牡蠣,二、三倍體長牡蠣均取自榮成市桑溝灣海區,取樣時間為4月—6月,每月取二倍體50個,三倍體100個。

1.2 實驗方法

1.2.1 倍性檢測 根據文獻[22]的方法,取2～5根鰓絲放入1×PBS緩沖液中剪碎,300目篩絹過濾至預冷的無水乙醇中,4 ℃冰箱過夜沉降。吸取沉淀加到離心管中,PBS緩沖液重懸細胞,用熒光染料碘化丙啶(Propidium lodide,PI)對細胞DNA染色,采用流式細胞儀(Beckman CytoFLEX)測定DNA分子熒光強度,峰值為二倍體長牡蠣的1.5倍視為三倍體。

1.2.2 組織學分析 根據文獻[22]的方法,取約綠豆粒大小的性腺組織置于10倍體積的Bouin’s固定液中固定24 h,75 %酒精置換之后梯度脫水、透明、石蠟包埋切片,用蘇木精-曙紅(H.E)染色法染色,封片晾干后用光學顯微鏡(Olympus BX53)觀察并拍照。根據性腺成熟度劃分為增殖期(Stage 1)、生長期(Stage 2)和成熟期(Stage 3),對于α和β類型三倍體的判定參照Jouaux等[1],其中3nα為可育型,3nβ為不可育型。

1.2.3 長牡蠣性腺總RNA提取 取黃豆粒大小的性腺組織樣品放入無酶離心管中,加入1 mL TRIzol試劑,將組織攪碎勻漿,加入200 μL氯仿;12 000 r/min 4 ℃,離心15 min;取上層水相,加入400 μL異丙醇;12 000 r/min 4 ℃,離心10 min;倒掉上層液體,加入預冷過的75 %乙醇1 mL,7 500 r/min 4 ℃,離心5 min;倒掉上層乙醇溶液,干燥10～15 min;加30～50 μL DEPC水溶解RNA,檢測RNA濃度和純度,于-80 ℃保存。

1.2.4 cDNA合成 利用反轉錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA)將RNA反轉錄成cDNA第一條鏈,所得cDNA于-20 ℃保存。

1.2.5 引物設計與合成 熒光定量分析所用引物序列如表1所示,使用EF1α基因作為內參基因[23],對AMPK基因在不同倍性長牡蠣性腺組織的表達量進行測定。為探究AMPK基因在長牡蠣性腺發育過程中是否參與調節糖原或脂質代謝,我們還選取了糖、脂代謝相關的AMPK潛在靶基因:Raptor、GCS、CREB[15]、ACC[15]和SREBP1[15]進行表達量分析。Raptor、GCS引物均使用Primer Premier 5.0設計,其余引物序列引自文獻[15]。

表1 熒光定量引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.2.6 熒光定量PCR 使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ Kit,通過實時熒光定量PCR儀器(Roche,LightCycler 480 II)進行基因的相對表達量測定。每組設置6個生物學重復。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blotting) 性腺組織用預冷的PBS緩沖液洗凈,加入裂解液后進行勻漿,勻漿管放置冰上裂解30 min,12 000 r/min 4 ℃離心10 min,收集上清總蛋白溶液,加入上樣緩沖液后沸水浴變性15 min,電泳,按照Phospho-AMPK α(Thr172)(CST,#2535)抗體說明書進行操作;最后進行化學發光。

1.2.8 免疫組織化學 4%多聚甲醛(PFA)固定液固定12 h,甲醇置換3次去除固定液。按照石蠟切片常規流程脫水、透明、包埋和切片。石蠟切片脫蠟。按照Phospho-AMPK α(Thr172)(40H9)Rabbit mAb(CST,#2535)抗體說明書進行實驗操作,脫水封片后用光學顯微鏡(Olympus BX51)觀察并拍照。

1.2.9 數據處理與統計 根據2-ΔΔCt法得到基因相對表達量數據。實驗數據采用SPSS 21.0軟件進行統計分析,用單因素方差分析(One-Way ANOVA)對差異表達進行顯著性檢驗,多重比較采用Dunnett’s T3檢驗,顯著水平為P<0.05。

2 結果

2.1 AMPK基因在長牡蠣性腺發育過程中的表達

熒光定量PCR結果顯示,AMPKα/β/γ基因mRNA在二、三倍體長牡蠣性腺發育過程中都有表達,在二倍體中三個基因隨性腺發育表達量下降,而三倍體中表達趨勢相反(見圖1)。二倍體中,AMPKα和AMPKβ在增殖期的表達量顯著高于成熟期,AMPKγ在雌性中增殖期的表達量顯著高于成熟期,雄性中增殖期和成熟期表達量變化不顯著。三倍體長牡蠣在增殖期時無法區分雌、雄和育性,與同時期的二倍體相比,三倍體增殖期3個AMPK基因表達量均低于二倍體,其中AMPKα和AMPKγ差異顯著(P<0.05)。成熟期中,AMPKα基因在3nβ的雌性和雄性中表達量較增殖期均顯著升高,在3nα雄性中的表達量較增殖期顯著升高(P<0.05);AMPKβ在3nβ雄性個體中,表達量較增殖期顯著升高(P<0.05);AMPKγ的表達趨勢與AMPKα類似。

(Stage 1: 增殖期; Stage 3: 成熟期; 2n: 二倍體; 3n: 三倍體; 3nα: 三倍體α; 3nβ: 三倍體β; None: 不分雌雄; ♀: 雌性; ♂: 雄性。所有的結果都用平均值±標準差(mean±SD)來表示, n=6; 同一圖中的柱形圖上不同的字母(a、b、c)表示差異顯著(P< 0.05)。 Stage 1: Proliferative stage; Stage 3: Mature stage; 2n: Diploid; 3n: Triploid; 3nα: Triploid α; 3nβ: Triploid β; None: Unable to distinguish between male and female; ♀: Female; ♂: Male. All the results were expressed as mean±SD, n=6; different letters (a、b、c) on the column chart in the same figure indicate significant differences(P<0.05).)圖1 AMPK α/β/γ基因mRNA在長牡蠣性腺發育過程中的表達Fig.1 Expression levels of AMPK α/β/γ mRNA during gonadal development of C. gigas

2.2 AMPK α磷酸化水平在長牡蠣性腺發育過程中的變化

利用蛋白免疫印跡法分析AMPK α磷酸化水平(p-AMPK α),結果顯示二倍體長牡蠣p-AMPK α在增殖期最高,雌性顯著高于雄性(P<0.05),到成熟期時,p-AMPK α水平顯著降低(P<0.05),雄性幾乎檢測不到磷酸化水平(見圖2)。三倍體增殖期p-AMPK α水平較高,3nα型長牡蠣生長期和成熟期中p-AMPK α水平顯著下降(P<0.05),成熟期幾乎檢測不到磷酸化(見圖3);3nβ型長牡蠣生長期p-AMPK α水平顯著增加,且顯著高于3nα型,在成熟期依然存在磷酸化水平,顯著高于同時期的二倍體和3nα型。

(Stage 1: 增殖期; Stage 3: 成熟期; ♀: 雌性; ♂: 雄性。 Stage 1: Proliferative stage; Stage 3: Mature stage; ♀: Female; ♂: Male.)圖2 二倍體長牡蠣性腺發育過程中AMPK α Thr172磷酸化水平Fig.2 Thr172 phosphorylation of AMPK α during gonadal development in diploid C. gigas

(Stage 1: 增殖期; Stage 2 α: 生長期α; Stage 2 β: 生長期β; Stage 3 α: 成熟期α; Stage 3 β: 成熟期β; None: 不分雌雄; ♀:雌性; ♂: 雄性。 Stage 1: Proliferative stage; Stage 2 α: Development stage α; Stage 2 β: Development stage β; Stage 3 α: Mature stage α; Stage 3 β: Mature stage β; None: Unable to distinguish between male and female; ♀: Female; ♂: Male.)圖3 不同育性三倍體長牡蠣性腺發育過程中AMPK α Thr172磷酸化水平Fig.3 Thr172 phosphorylation of AMPK α during gonadal development in different types of triploid C. gigas

2.3 AMPK α蛋白在長牡蠣性腺發育過程的表達

采用免疫組織化學技術檢測AMPK α活性蛋白在長牡蠣性腺中的表達情況。結果顯示:AMPK α活性蛋白在卵子發生的各時期均有表達,隨著卵細胞的逐漸成熟,其免疫染色強度降低,至成熟期卵細胞的免疫染色最弱(見圖4的1,3,5);在雄性的精原細胞和精母細胞中也檢測到明顯信號,但在精細胞和精子中AMPK α蛋白的表達非常弱,幾乎檢測不到(見圖4的2,4,6)。AMPK α蛋白在二倍體、三倍體長牡蠣性腺濾泡細胞中都有表達(見圖4和5)。

(1: 增殖期雌性; 2: 增殖期雄性; 3: 生長期雌性; 4: 生長期雄性; 5: 成熟期雌性; 6: 成熟期雄性。 CT: 結締組織; OO: 卵原細胞; DO: 未成熟卵子; MO: 成熟卵子; SPG: 精原細胞; SP: 精細胞; SPZ: 精子。 棕色為陽性信號。 標尺: 50 μm。 1: Proliferative stage female; 2: Proliferative stage male; 3: Development stage female; 4: Development stage male; 5: Mature stage female; 6: Mature stage male. CT: Connective tissue; OO: Oogonia; DO: Developing oocyte; MO: Mature oocyte; SPG: Spermatogonia; SP: Spermatid; SPZ: Spermatozoa. Brown refer to positive signals. Scale bar: 50 μm.)圖4 二倍體長牡蠣(C. gigas)性腺發育過程中AMPK α蛋白表達情況Fig.4 Expression of AMPK α protein during gonadal development in diploid C. gigas

(1: 增殖期, 不分雌雄; 2: 成熟期α雌性; 3: 成熟期α雄性; 4: 成熟期β雌性; 5: 成熟期β雄性。 FW: 濾泡壁; G: 性原細胞; CT: 結締組織; DO: 未成熟卵子; MO: 成熟卵子; SP: 精細胞; SPZ: 精子。 棕色為陽性信號。 標尺: 50 μm。 1: Proliferative stage, unable to distinguish between male and female; 2: Mature stage α female; 3: Mature stage α male; 4: Mature stage β female; 5: Mature stage β male. FW: Follicle wall; G: Gonia; CT: Connective tissue; DO: Developing oocyte; MO: Mature oocyte; SP: Spermatid; SPZ: Spermatozoa. Brown refer to positive signals. Scale bar: 50 μm.)圖5 不同育性三倍體長牡蠣(C. gigas)性腺發育過程中AMPK α蛋白表達情況Fig.5 Expression of AMPK α protein during gonadal development in different types of triploids C. gigas

2.4 AMPK潛在靶基因在長牡蠣性腺發育過程的表達

熒光定量PCR結果如圖6所示。糖原合成酶基因GCSmRNA表達量在二倍體和3nα長牡蠣性腺增殖期和成熟期無顯著性變化;在3nβ中,成熟期顯著高于增殖期(P<0.05)(見圖6(A))。cAMP反應元件結合蛋白基因(CREB)mRNA在二倍體和三倍體中均是成熟期表達量顯著高于增殖期,在成熟期,雌性二倍體、3nα雌性和3nβ雌性間CREB表達量差異不顯著,3nβ雄性中CREB表達量顯著低于二倍體雄性和3nα雄性(見圖6(B))。乙酰輔酶A羧化酶基因(ACC)mRNA在二倍體雌性長牡蠣性腺發育過程中沒有明顯變化,在二倍體雄性性腺成熟期顯著降低,成熟期雌雄差異顯著,雌性顯著高于雄性(P<0.05);在三倍體中,3nα和3nβACC表達量差異不顯著(見圖6(C))。固醇調節元件結合蛋白基因(SREBP1)在二倍體和三倍體長牡蠣性腺發育過程中的mRNA表達量都是上升的,成熟期表達量顯著高于增殖期(P<0.05),在成熟期時,二倍體和3nα型雌性表達量均顯著高于雄性(P<0.05)(見圖6(D))。mTOR調控相關蛋白基因(Raptor)在二倍體雄性長牡蠣性腺增殖期表達量顯著高于成熟期(P<0.05),在二倍體雌性增殖期表達量顯著低于成熟期,且成熟期表達量雌雄差異顯著(P<0.05);在三倍體中的Raptor表達量則呈上升趨勢,3nβ雄性表達量顯著高于增殖期(見圖6(E))。

((A): 糖原合成酶; (B): cAMP反應元件結合蛋白; (C): 乙酰輔酶A羧化酶; (D): 固醇調節元件結合蛋白1;(E): mTOR調控相關蛋白。 Stage 1: 增殖期; Stage 3: 成熟期; 2n: 二倍體; 3n: 三倍體; 3nα: 三倍體α; 3nβ: 三倍體β; None: 不分雌雄; ♀: 雌性; ♂: 雄性。 所有的結果都用平均值±標準差(mean±SD)來表示, n=6;不同的字母(a—d)表示差異顯著(P<0.05)。(A): Glycogen synthase; (B): cAMP-response element binding protein; (C): Acetyl-CoA carboxylase; (D): Sterol regulatory element-binding protein l; (E): Regulatory-associated protein of mTOR. Stage 1: Proliferative stage; Stage 3: Mature stage; 2n: Diploid; 3n: Triploid; 3nα: Triploid α; 3nβ: Triploid β; None: Unable to distinguish between male and female; ♀: Female; ♂: Male. All the results were expressed as mean±SD, n=6; different letters (a—d) indicate significant differences(P<0.05).)圖6 AMPK潛在靶基因mRNA在長牡蠣性腺發育過程中的表達Fig.6 Expression levels of AMPK putative target genes mRNA during gonadal development of C. gigas

3 討論

AMPKα/β/γ基因mRNA在不同倍性長牡蠣性腺發育過程中都有表達。在二倍體中,AMPKα和AMPKβ亞基在增殖期性腺的表達量顯著高于成熟期,AMPKγ亞基在雌性中增殖期的表達量顯著高于成熟期,雄性中增殖期和成熟期表達量變化不顯著,說明AMPKα/β/γ亞基可能在長牡蠣性腺發育早期起重要調控作用。三倍體長牡蠣的AMPKα/β/γ亞基mRNA表達趨勢與二倍體相反,三倍體增殖期3個亞基表達量均低于二倍體,成熟期時,AMPKα在3nβ和3nα個體中表達量較增殖期明顯升高,在3nβ顯著升高,AMPKβ和AMPKγ在3nβ雄性個體中,表達量較增殖期顯著升高。AMPK基因在二倍體、三倍體長牡蠣性腺發育中表達差異可能與二倍體、三倍體性腺發育過程中能量轉化及代謝差異密切相關。

AMPK α蘇氨酸172(Thr 172)是AMPK激活的決定因子和必需的磷酸化位點[5],只有AMPK α亞基Thr 172位點被磷酸化后才能激活并調節下游目標。二倍體牡蠣性腺p-AMPK α水平在增殖期顯著高于成熟期,表明AMPK在增殖期活性高于成熟期。有研究報道,活化的AMPK可以增強葡萄糖的攝取和脂肪酸的氧化分解代謝,抑制糖類、脂類和蛋白質的合成代謝[24]。在長牡蠣的配子發生過程中,需要消耗大量的營養物質用來供給能量和提供配子發育的組成物質,AMPK作為細胞能量穩態的維持者,在二倍體牡蠣增殖期高AMPK α磷酸化水平,可能加強糖原分解、脂質氧化分解和葡萄糖攝取等,產生ATP以供配子發生。3nβ牡蠣性腺生長期的磷酸化水平顯著高于可育型,且3nβ在成熟期檢測到一定的磷酸化水平,表明AMPK活性的差異可能與三倍體長牡蠣不育相關。AMPK基因被認為會對細胞增殖起負向調控作用,研究表明活化的AMPK會降低大鼠支持細胞的增殖,并增加細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKI、p19INK4d、p21Cip1和p27Kip1)的表達[25],也會降低顆粒細胞的生長和有絲分裂[17,21]。3nβ長牡蠣生長期和成熟期相對較高水平的p-AMPK α可能抑制了其配子增殖,從而導致不育。另外,AMPK α磷酸化水平在雌性增殖期中更高,表明AMPK可能在卵子發生過程中具有更廣泛的調控作用。AMPK α活性蛋白主要集中在濾泡細胞、卵原細胞、卵母細胞、精原細胞和精母細胞的細胞質和細胞核中,這與哺乳動物的研究結果相似[26],說明AMPKα亞基可能是調控長牡蠣卵原細胞、卵母細胞、精原細胞和精母細胞發育的重要因子。

AMPK可以通過調控下游基因的轉錄和磷酸化各式底物的方式促進葡萄糖轉運和分解代謝、促進脂肪酸氧化、抑制糖異生、抑制脂肪酸和蛋白質合成,從而維持細胞的物質和能量平衡[27-28]。ACC是脂質合成的限速酶基因,在脂質代謝過程中起著重要作用[29],激活的AMPK蛋白可以磷酸化ACC從而降低ACC活性,進而減少脂肪酸合成并提高脂肪酸的氧化量,以適應能量增加的需求[30]。ACCmRNA表達量在二倍體長牡蠣雄性性腺中顯著降低,與二倍體AMPKαmRNA和p-AMPK α的變化一致,表明AMPK激活可能正調控雄性長牡蠣性腺中ACC的轉錄,但與ACC磷酸化程度的調控關系還需后續深入研究。SREBP1基因是細胞內調控脂質代謝的關鍵轉錄因子,主要調控膽固醇和脂肪酸合成中關鍵酶基因的表達,調節脂肪酸和膽固醇合成,AMPK可以抑制SREBP1的表達[31]。本研究中,SREBP1mRNA表達量變化與AMPK α磷酸化水平變化呈負相關,說明牡蠣性腺中AMPK的激活可能抑制SREBP1的表達,進而抑制脂肪酸和膽固醇合成。CREB是cAMP反應元件CRE的結合蛋白基因,與CRE結合后能大大提高下游基因的轉錄活性,是糖異生過程中的重要信號轉導因子[32],研究表明AMPK通常是調控CREB的共激活因子CRTC2的磷酸化,破壞CREB/CRTC2復合體來影響CREB的功能[33],但在大鼠肌肉和肝臟中AMPK可直接磷酸化并激活CREB[34]。本研究中,二倍體和3nα長牡蠣性腺中CREB基因的表達均在成熟期顯著增加,與Guévélou[15]的研究結果一致,AMPK激活可能對CREB的轉錄表達起到負調控作用。研究發現蛋白質代謝也會受AMPK調控,AMPK可通過磷酸化mTORC1結合Raptor,阻斷mTOR信號通路[35],影響蛋白質的翻譯合成以及抑制自噬作用等,進而調控細胞的生長和增殖[36]。Raptor基因在二倍體牡蠣雄性性腺中的表達變化趨勢與AMPKαmRNA和磷酸化水平變化一致,在雌性性腺中的表達則相反,這提示AMPK可能參與雄性性腺中Raptor基因的轉錄,推測是由于雄性性腺在增殖期有絲分裂旺盛,需要合成大量蛋白質的原因。靶基因的mRNA表達結果表明,CREB和SREBP1基因與AMPKαmRNA和磷酸化水平存在一定相關性,說明AMPK可能參與調控這兩個基因的轉錄。

AMPK基因在不同育性長牡蠣性腺發育過程中的調控是不一樣的。在可育型長牡蠣性腺發育早期,糖原和脂質的大量分解為生殖細胞增殖和分化提供能量,能量過盛導致AMPK基因表達被抑制,從而保證性腺發育過程中持續的能量供給;而在不可育型長牡蠣中,由于性腺發育受阻,不需要大量的能量供給配子發生,因此AMPK并未被抑制,而是發揮能量穩態的調控作用,維持機體的正常生命活動。