溫度、鹽度和密度對菲律賓蛤仔稚貝生長和存活的影響?

吳 磊, 涂 康, 周麗青, 劉志鴻, 吳 彪, 孫秀俊??

(1.中國水產科學研究院黃海水產研究所, 山東 青島 266071;2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室,山東 青島 266237; 3. 江蘇海洋大學海洋科學與水產學院, 江蘇 連云港 222005; 4. 莆田市水產研究所, 福建 莆田 351100)

溫度、鹽度和密度是影響海洋貝類生長的重要環境因子[1-6]。溫度與貝類胚胎發育及早期幼蟲的生長、發育、攝食等生命過程密切相關[2,7],例如,在13～33 ℃范圍內,溫度對香港巨牡蠣(Crassostreahongkongensis)的濾水率、攝食率和吸收率的影響極顯著[8]。研究表明,鹽度變化不僅直接影響櫛江珧(Atrinapectinate)胚胎發育及早期幼蟲的攝食和代謝,而且對滲透壓調節相關的Na+/K+-ATP酶活性影響尤為顯著[2,9-10]。密度過高會導致養殖個體之間對空間和食物的競爭,也是影響貝類等其他水產動物早期生長和存活的重要因素[5,11-13],例如,密度過高引起青蛤(Cyclinasinensis)體腔液中異養細菌和弧菌的數量顯著上升,導致早期生長速度下降,死亡率顯著升高[13-14]。在潮間帶,溫度、鹽度和pH等是影響菲律賓蛤仔生長和存活的重要環境因子[1]。目前,有關貝類生長環境因子研究大部分都集中在單因子或雙因子,而多種環境因子及其相互作用對貝類生長和存活的影響尚不明確。

響應面法(Response surface methodolody, RSM)是解決多變量因子問題的一種重要統計方法,利用合理的實驗設計方案,可降低實驗次數、優化各變量因子,是開展多因子及其互作效應研究的重要手段[15]。在響應面法分析過程中,利用Design-Expert 12軟件結合Box-Behnken Design實驗設計方案,對得到的數據進行統計分析,通過擬合曲線建立數學模型,可直觀地反映實驗因素和響應值之間的關系。目前,響應面法是研究多種環境因子對貝類生長和存活影響的重要手段[1,6,12]。

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)隸屬于軟體動物門雙殼綱簾蛤目簾蛤科,廣泛分布于朝鮮、日本及我國沿海[16]。菲律賓蛤仔肉質鮮美、營養豐富,深受國內外消費者喜愛。蛤仔是一種主要棲息在軟泥砂底質中、營埋棲生活的灘涂貝類,具有生長速度快、養殖成本低和環境適應性強等特點,是我國重要的灘涂貝類養殖品種。我國是菲律賓蛤仔養殖大國,近年來年產量約400萬t,蛤仔育苗和養殖是我國南北沿海漁業貝類經濟的重要支柱產業之一[17]。在蛤仔產業,蛤仔苗種的穩定生產是蛤仔養殖業健康、可持續發展的關鍵。在蛤仔早期生長階段,環境因子對蛤仔苗種的生長和存活具有重要影響[1,18-19]。因此,提高貝類苗種產量,迫切需要掌握苗種生長的適宜溫度、鹽度和密度等環境因子。本研究以我國重要灘涂貝類菲律賓蛤仔為研究對象,采用響應面分析方法,探究溫度、鹽度、密度三因素及其相互作用對蛤仔稚貝生長和存活的影響,構建蛤仔稚貝在不同環境條件下的生長模型,以期獲得蛤仔適宜的環境條件,為優化蛤仔苗種的培育管理、提高苗種的質量和產量提供理論指導和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

稚貝采集于福建莆田貝類育苗基地,由同一批次幼體培育而成。正式實驗前室內暫養7 d,使用游標卡尺(精度為0.01 mm)隨機測量100粒稚貝殼長,平均殼長(1.85±0.03) mm,45日齡。海水溫度(18±1) ℃,鹽度30±1。所用海水均經過砂濾后,300目篩絹網過濾,紫外線消毒0.5 h,并提前配制各實驗組。

1.2 實驗方法

采用3 L塑料透明小桶培育稚貝,300 W可控溫浸入式電子加熱棒或冷水機控制海水溫度(±0.5 ℃),并使用電子溫度計(±0.1 ℃)觀測溫度變化,采用小型充氣泵對培育水體進行不間斷充氣。本實驗采用的環境因子范圍參考前期研究報道,使用軟件Design-Expert 12進行BBD (Box-Behnken Design) 實驗方案設計和響應曲面分析(RSM)[1,18]。設計響應面3因素(溫度、鹽度、密度)、3水平(-1、0、1)的二次多項回歸組合實驗(見表1和表2)。一共14組,每組設置3個平行,實驗容器為3 L透明小桶。養殖桶中放入活力好且規格一致的稚貝150枚(密度:1×104粒/m2)、450枚(密度:3×104粒/m2)和750枚(密度:5×104粒/m2),置于塑料盒中進行水浴控溫。

表2 響應面三因素三水平方案與實驗結果Table 2 Response surface three factors and three levels scheme and test results

實驗期間,溫度升降依靠加熱棒或冷水機進行水浴控溫,循環水泵使溫度均勻,水溫從18 ℃開始,以1 ℃/2 h的速率升溫或降溫達到設定的實驗溫度。低鹽海水通過向自然海水中添加過濾自來水配置,折射鹽度計(ATAGO)測定鹽度,精度為±0.1%。按±3/h的升降速率達到各自實驗鹽度。餌料投喂濃縮角毛藻(Chaetoceroscalcitrans),確保餌料密度為1×104個/mL。每天換水,換水量1/2,及時清理污物。在實驗結束后用游標卡尺(精確度達0.01 mm)測量各組稚貝殼長和成活率。

2 結果

2.1 溫度、鹽度、密度及交互作用對蛤仔平均殼長的影響

稚貝培育73 d后,不同實驗組的平均殼長見表2。

隨著溫度的升高,殼長呈先上升后下降的趨勢,溫度對稚貝生長具有顯著影響(P<0.05,見圖1);隨著鹽度的增加,殼長也呈先上升后下降的趨勢,但影響不顯著(P>0.05,見圖2);隨著密度的增大,蛤仔殼長呈先上升后下降的趨勢,密度對稚貝生長具有顯著影響(P<0.05,見圖3)。溫度32 ℃時,各組稚貝的平均成活率為(75.87±7.00)%,溫度15 ℃時,各組稚貝的平均成活率為(96.16 ± 1.56)%,兩者差異極顯著(P<0.01,見圖4)。然而,密度和鹽度對稚貝的成活率影響不顯著(P>0.05,見圖4)。Design-Expert分析結果顯示,溫度、鹽度、密度的二次效應對稚貝生長影響極顯著(P<0.01)。響應面設計軟件Design-Expert 12 對殼長進行二元多次回歸擬合,得到各環境因子間的相互作用對蛤仔生長的影響。等高線的形狀反應了兩個因素的交互作用,如等高線呈現橢圓型,則兩個環境因素之間的有交互作用。等高線幾乎呈圓形,則表明鹽度、溫度和密度之間的交互作用不明顯(見圖5—7),且方差分析結果也證實了因子間的交互作用不顯著(P>0.05,見表3)。

(中間實線表示平均殼長,上虛線表示平均殼長最大值,下虛線表示平均殼長最小值。下圖同。 The middle solid line represents the average shell length, the upper dotted line represents the maximum average shell length, and the lower dotted line represents the minimum average shell length. Same as the picture below.)圖1 溫度對蛤仔稚貝平均殼長的影響Fig.1 Effects of temperature on average shell length of juvenile clam

圖2 鹽度對蛤仔稚貝平均殼長的影響Fig.2 Effects of salinity on average shell length of juvenile clam

圖3 密度對蛤仔稚貝平均殼長的影響Fig.3 Effects of density on average shell length of juvenile clam

(不同字母代表組間差異顯著,(P<0.05 )。圖右側表格表示橫坐標中1—14組各組的溫度、鹽度和密度條件。Different letters represent significant differences among species, P<0.05). The table on the right side of the figure represents the temperature, salinity and density conditions for each of the groups 1—14 in the horizontal coordinates.)圖4 蛤仔生長73 d后各實驗組的存活率Fig.4 Survival rates of clams in each experimental group after 73 days of growth

圖5 溫度和鹽度交互作用對蛤仔殼長生長影響Fig.5 Effects of the interaction of temperature and salinity on the growth of clam shell length

圖6 密度和溫度交互作用對蛤仔殼長生長影響Fig.6 Effects of the interaction of density and temperature on the growth of clam shell length

圖7 密度和鹽度交互作用對蛤仔殼長生長影響Fig.7 Effects of the interaction between density and salinity on the growth of clam shell length

表3 殼長回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the shell length regression model

2.2 蛤仔稚貝生長模型的擬合優化

通過Design-Expert 12 軟件對殼長數據進行分析,建立二次響應面回歸模型,分析結果見表3。獲得殼長預測值Y對編碼自變量溫度(T)、鹽度(S)和密度(D)的二次多項回歸方程:Y=-6.366+0.276T+0.584S+0.636D-0.0004TS+0.002 8TD-0.000 6SD-0.005 66T2-0.013 7S2-0.115 9D2。式中:TS為溫度與鹽度的互作效應;TD為溫度與密度的互作效應;SD為鹽度與密度的互作效應;T2為溫度的二次效應;S2為鹽度的二次效應;D2為密度的二次效應;R2為模型的決定系數;AdjustedR2為模型的校正決定系數;PredictedR2為模型的預測決定系數。R2=0.787,AdjustedR2=0.306,PredictedR2=-2.415;模型的決定系數R2為0.787,說明總變異的22%不能用此模型解釋。該模型不顯著,所以需要進一步優化,優化后的結果見表4。重新回歸后的方程:Y=-6.331 05+0.276 5T+0.573S+0.689D-0.005 66T2-0.013 7S2-0.115 9D2, 式中:R2=0.781 6,AdjustedR2=0.594 4,PredictedR2=0.126 5;模型的決定系數R2為0.781 6,說明該模型能解釋78.16%的變化,該模型達到顯著性水平(P<0.05,見表4)。由方差分析可知,溫度、鹽度、密度對模型影響不顯著(P>0.05),但是溫度、鹽度、密度的二次項對模型的影響顯著(P<0.05),其中鹽度的二次項對模型產生的影響極顯著(P<0.01);利用此模型在多因素條件下進行分析和預測,可計算出三因素下的最優條件:溫度為24.32 ℃,鹽度為21.13,密度為2.88×104粒/m2,此時殼長可達最大值4.07 mm。

表4 剔除交互作用后的回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model after excluding interaction

3 討論

溫度是影響海洋貝類生長的關鍵環境因子之一。菲律賓蛤仔是生活在潮間帶的埋棲型貝類,其生長速度極易受到外界環境溫度的影響[4,6]。菲律賓蛤仔溫度耐受范圍廣,適應溫度范圍為5～35 ℃,但最適宜生長的環境水溫為15～30 ℃[18,20]。本研究通過響應面法分析了溫度、鹽度、密度三個因子及其互作效應對蛤仔稚貝生長和存活的影響,結果表明蛤仔稚貝生長的最適溫度為24.32 ℃,與已報道的最適生長溫度25 ℃結果相近[1,18]。大量研究表明,隨著溫度的升高,貝類早期生長呈先上升后下降的趨勢,即表現出拋物線形的特征[1-2,5-7,21]。這與本實驗的研究結果一致,在適宜溫度范圍內,蛤仔稚貝生長速度與溫度呈正相關,但超出溫度的適宜范圍,生長速度會出現不同程度的下降。研究發現,大部分濾食性貝類,當溫度在適宜范圍內,隨著溫度的升高,可導致稚貝的攝食活動活躍,攝食量增加,從而導致稚貝的快速生長[4,6,8,22-23]。然而,溫度過高會加速水中微生物繁殖,降低水體溶氧量,從而影響稚貝的生長和存活[4,24]。本研究結果也證實,高溫會導致蛤仔稚貝的存活率顯著下降。另外,劇烈的溫度變化同樣會影響貝類的代謝速率、血細胞和酶活等生理代謝,減弱機體免疫防御能力,從而影響貝類的生長和存活[4,6,25]。因此,本研究結果證實,在蛤仔苗種培育過程中,維持環境水溫25 ℃左右,避免溫度的劇烈波動,能夠顯著促進稚貝的生長和提高苗種成活率。

除溫度外,鹽度也是影響海洋貝類生長和存活的重要環境因子。作為長期生長在潮間帶的埋棲型貝類,菲律賓蛤仔的生長和存活同樣會受到鹽度的影響。研究表明,菲律賓蛤仔生長適宜的鹽度范圍為14～27,但稚貝生長的最適鹽度為20～23[1,18,20]。這與本實驗中的多因子響應面法分析結果一致,本研究發現蛤仔稚貝在鹽度21.13時生長速度最快,這進一步確定了蛤仔早期階段的最適生長鹽度。另外,本研究中發現蛤仔苗種生長速度隨鹽度增加呈先升高后降低的趨勢,這與鹽度對其他貝類生長速度的影響規律相似[1,4,6,25-27]。在鹽度的適宜范圍內,貝類具有調節滲透壓的能力,機體會根據水體鹽度變化調節細胞膜上的Na+/K+-ATP酶來維持體內外平衡,從而影響貝類的新陳代謝、攝食率和免疫能力等生理特征[4,6,25]。然而,鹽度過低或過高對貝類的新陳代謝和生長都具有不利影響[2,12,25,28]。貝類長時間生活在過高或過低的鹽度環境中,可導致滲透壓調節失衡,直接影響貝類的存活[4]。在本研究中,高鹽和低鹽環境可能造成蛤仔體內的滲透壓失衡,從而改變機體的新陳代謝,最終對其生長和存活造成不利影響。因此,在蛤仔苗種培育過程中,維持適宜的鹽度(21～23)對于苗種的生長和成活尤為重要。

培育密度也是影響貝類苗種生長和存活的重要因子,培育密度的高低主要影響養殖貝類對空間和食物的競爭等,尤其對于蛤仔等埋棲型灘涂貝類[29]。本實驗研究結果表明,在一定密度范圍內,蛤仔苗種生長速度和密度呈正相關,殼長生長達到最大值,而密度過高會限制苗種的生長,例如,對于蛤仔浮游幼蟲,其最適培育密度為10個/mL,而過高密度會影響浮游幼蟲的生長和附著變態[19]。本研究通過三因子實驗的響應面法分析,揭示蛤仔苗種的最適培育密度為2.88×104粒/m2。研究發現,貝類的排泄物質(主要為含氮化合物)隨著養殖密度的增高而增加,容易敗壞水質,進而影響貝類的生長和存活[5]。本研究通過三因子實驗結果進一步證實,過高的苗種培育密度可能直接導致苗種缺氧及其對空間和食物的競爭,這對于苗種的生長和存活是非常不利的。因此,在蛤仔苗種培育過程中,選擇合理的培育密度(約3×104粒/m2)是十分必要的。

許多研究表明,當環境因子在合理范圍內,溫度和鹽度的交互作用對貝類生長影響不顯著,而當兩者其中之一接近機體的耐受極限時,其互作效應才會顯著影響貝類生長[1,3-4,12,30],例如,溫度和鹽度對華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)幼貝生長和存活的影響存在顯著互作效應,當鹽度處于最適宜范圍時, 幼貝最適溫度范圍最大; 而鹽度接近耐受極限時, 幼貝的最適溫度范圍明顯變小[31];隨著櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)幼蟲生長發育,其環境耐受力不斷增強,溫度和鹽度偏離極端耐受值,兩者相互作用對生長無顯著影響[8]。然而,本研究結果表明,溫度、鹽度和密度的交互作用對蛤仔苗種生長影響不顯著,可能由于各環境因子均設置在合理范圍內,并未接近苗種生長的極限耐受值。因此,本研究通過設置合理的環境因子范圍,結合三因子實驗設計方案,建立了蛤仔苗種在不同環境下的生長模型,揭示各因子對苗種成活率的影響,研究結果對于蛤仔苗種培育具有重要的參考價值。

綜上所述,本研究采用響應面法分析溫度、鹽度、密度及互作效應對蛤仔苗種生長和成活的影響,擬合獲得殼長的二次響應面回歸方程,通過生長模型得出最適環境因子:溫度24.32 ℃,鹽度21.13,密度2.88×104粒/m2。本研究獲得了蛤仔苗種培育的最適環境條件,研究結果對于優化蛤仔苗種培育管理、提高蛤仔苗種產量具有重要的借鑒和參考價值。