川牛膝對(duì)淡水石斑魚部分血清抗氧化指標(biāo)的影響

孫曉旺，鄭艷坤，馬 林，李明澤，尤宏?duì)?，畢相東，孫學(xué)亮*

（ 1. 天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221 ；2. 天津市農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300161 ； 3. 天津農(nóng)學(xué)院，天津 300192 ）

淡水石斑魚（Cichlasoma managuense）屬于脊索動(dòng)物門、脊椎動(dòng)物亞門、硬骨魚綱、輻鰭亞綱，別稱石斑魚。淡水石斑魚原產(chǎn)自中美洲尼加拉瓜，廣東、江西等養(yǎng)殖單位引入后進(jìn)行推廣養(yǎng)殖[1]。淡水石斑魚具有生長(zhǎng)速度快、耐低氧、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，不僅肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，而且外形美觀、體態(tài)優(yōu)美，既可以作為商品魚食用，還可以作為觀賞魚，是一種值得推廣的淡水優(yōu)良品種[2]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)淡水石斑魚的養(yǎng)殖技術(shù)愈發(fā)重視，淡水石斑魚的養(yǎng)殖規(guī)模也越來(lái)越大，逐漸成為淡水養(yǎng)殖中的重要品種[1-3]。

川牛膝（Radix cyathulae）屬于植物界、被子植物門、雙子葉植物綱、莧科，別稱白牛膝、拐牛膝、肉牛膝，為莧科植物川牛膝的干燥根[4]。采集時(shí)需秋、冬二季采挖，除去蘆頭、須根及泥沙，烘或曬至半干，堆放回潤(rùn)，再烘干或曬干[5]。其味甘、微苦，性平，具有逐瘀通經(jīng)，通利關(guān)節(jié)、利尿通淋等功效[5]。川牛膝用于治療經(jīng)閉癥瘕、胞衣不下、跌撲損傷、風(fēng)濕痹痛、足痿筋攣、尿血血淋等[5]。張鈺芹等[6]研究發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖還可通過(guò)調(diào)控腫瘤的微環(huán)境，改善機(jī)體的血液流變性，起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)淡水石斑魚的研究主要集中在養(yǎng)殖繁育、肌肉營(yíng)養(yǎng)等方面，川牛膝作為添加劑對(duì)淡水石斑魚的體內(nèi)抗氧化性的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究使用中草藥川牛膝添作為飼料添加劑飼養(yǎng)淡水石斑魚，旨在研究和評(píng)價(jià)川牛膝對(duì)淡水石斑魚體內(nèi)抗氧化性的影響，為淡水石斑魚的健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用450 尾淡水石斑魚，購(gòu)自天津市七里海水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。平均體長(zhǎng)（15.20±1.20） cm、體質(zhì)量（50.20±2.30） g，隨機(jī)分為5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚，飼養(yǎng)于15 個(gè)長(zhǎng)38 cm×寬26 cm×高36 cm 的水族箱中。水溫為（37.0±0.5） ℃，pH 值7.24，溶氧為6.0～6.2 mg/L。飼料選用福州海馬牌石斑魚商品飼料（Q/FZHM 005），飼料營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，每日投喂飼料量約為魚體重的1%。試驗(yàn)用川牛膝購(gòu)自天津市中草藥店，選取川牛膝植物根莖，使用研磨機(jī)械充分研磨成粉狀。

表1 試驗(yàn)飼料營(yíng)養(yǎng)水平Tab.1 Nutrient levels of the experimental diets 單位：%

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)設(shè)置5 個(gè)濃度梯度，在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的川牛膝（包括1個(gè)對(duì)照組和4個(gè)濃度梯度試驗(yàn)組），每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)期間，每天9：00和15：00分別對(duì)應(yīng)投喂含不同川牛膝濃度的飼料，每日投喂飼料量約為魚體重的1%。每日密切觀察受試淡水石斑魚的狀態(tài)，若發(fā)現(xiàn)魚體死亡，則及時(shí)撈出，稱重，記錄。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

分別在試驗(yàn)開(kāi)始第7、第14、第21 和第28 d 對(duì)試驗(yàn)魚進(jìn)行采樣，每個(gè)水族箱中每次取5條受試淡水石斑魚。使用2 mL注射器從受試淡水石斑魚的尾柄處插入受試魚體的動(dòng)脈中采集血液，注入已標(biāo)記好的離心管中，離心管中事先加入適量肝素，防止血液凝固，將已標(biāo)記好的離心管放入冰水中，避免無(wú)關(guān)因素對(duì)試驗(yàn)造成影響。取完同一水箱的魚血液樣品，4 ℃冰箱內(nèi)保存，并在1 d內(nèi)對(duì)血液進(jìn)行離心處理（4 ℃、4 000 r/min 離心10 min）。使用南京建成生物科技有限公司試劑盒對(duì)各血清樣品測(cè)定抗氧化指標(biāo)，包括谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、超氧化物歧化酶（CAT）、丙二醛（MDA）和總抗氧化能力（T-AOC）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理與統(tǒng)計(jì)，SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，Duncan's 法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清GSH-Px 活性的影響（見(jiàn)表2）

表2 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清GSH-Px活性的影響Tab.2 Effect of Radix cyathulae on the serum GSH-Px activity of the Cichlasoma managuense 單位：U/mL

由表2 可知，試驗(yàn)第14 d 時(shí)，0.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組、1.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗(yàn)第7 d和21 d時(shí)，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px 活性顯著高于0.5%川牛膝添加組和1.5%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗(yàn)28 d時(shí)，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但與其余各濃度組相比差異不顯著（P＞0.05）。

對(duì)照組淡水石斑魚在試驗(yàn)第7、第21 d 時(shí)淡水石斑魚血清GSH-Px 活性顯著高于試驗(yàn)第14、第28 d（P＜0.05）；2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗(yàn)第21 d 時(shí)的血清GSH-Px活性顯著高于試驗(yàn)第14、第28 d（P＜0.05）。

2.2 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清SOD活性的影響（見(jiàn)表3）

由表3 可知，試驗(yàn)第7 d 時(shí)，對(duì)照組淡水石斑魚血清SOD 活性顯著高于1.0%川牛膝添加組、1.5%川牛膝添加組、2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗(yàn)第14、第21 d 時(shí)，1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清SOD活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；試驗(yàn)第28 d 時(shí)，對(duì)照組淡水石斑魚血清SOD 活性顯著低于各試驗(yàn)組（P＜0.05）。對(duì)照組淡水石斑魚試驗(yàn)第7 d 時(shí)的血清SOD 活性顯著高于試驗(yàn)第28 d（P＜0.05）；1.0%川牛膝添加組、1.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗(yàn)第14 d 時(shí)的血清SOD 活性顯著高于試驗(yàn)第21 d時(shí)（P＜0.05）；且1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗(yàn)第14 d時(shí)的血清SOD活性最高（P＜0.05）。

2.3 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清CAT活性的影響（見(jiàn)表4）

表4 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清CAT活性的影響Tab.4 Effect of Radix cyathulae on the serum CAT activity of the Cichlasoma managuense 單位：U/mL

由表4可知，試驗(yàn)第7 d時(shí)，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清CAT活性顯著高于對(duì)照組和1.0%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗(yàn)第14 d 時(shí)，0.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清CAT 活性顯著高于2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗(yàn)第21、28 d 時(shí)，1.5%川牛膝添加組CAT 活性顯著高于2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）。0.5%川牛膝添加組各時(shí)間點(diǎn)淡水石斑魚的CAT 活性差異不顯著（P＞0.05）；1.0%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗(yàn)第28 d 時(shí)的血清CAT 活性顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05）；1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗(yàn)第21 d 時(shí)的血清CAT 活性顯著高于試驗(yàn)第7 和第14 d（P＜0.05）；2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗(yàn)第7 d時(shí)的血清CAT活性最高，顯著高于其他組（P＜0.05）。

2.4 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清MDA含量的影響（見(jiàn)表5）

表5 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清MDA含量的影響Tab.5 Effect of Radix cyathulae on the serum MDA concentration of the Cichlasoma managuense 單位：U/mL

由表5可知，對(duì)照組淡水石斑魚在試驗(yàn)第7 d時(shí)的血清MDA 含量顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05），且顯著高于1.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）。試驗(yàn)第14 d 時(shí)，1.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清MDA 含量顯著高于試驗(yàn)第7 d 時(shí)（P＜0.05）。試驗(yàn)第21 d 時(shí)，0.5%川牛膝添加組和1.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清MDA 含量顯著低于試驗(yàn)第28 d 時(shí)（P＜0.05）。試驗(yàn)第28 d 時(shí)，0.5%川牛膝添加組、1.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清MDA 含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.5 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清T-AOC的影響（見(jiàn)表6）

表6 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清T-AOC的影響Tab.6 Effect of Radix cyathulae on the serum T-AOC of the Cichlasoma managuense 單位：U/mL

由表6可知，試驗(yàn)第7 d時(shí)，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清T-AOC 顯著高于其他組（P＜0.05）；試驗(yàn)第14 d時(shí)，0.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清T-AOC顯著高于對(duì)照組、1.0%川牛膝添加組和1.5%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗(yàn)第21 d 時(shí)，0.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清T-AOC 顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；試驗(yàn)第28 d 時(shí)，1.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清T-AOC顯著高于對(duì)照組、0.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）。

1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗(yàn)第28 d 時(shí)淡水石斑魚的血清T-AOC 顯著高于試驗(yàn)第7、第14 d（P＜0.05）。2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚各時(shí)間點(diǎn)的血清T-AOC差異均不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清GSH-Px活性的影響

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種活性氧自由基清除劑，與CAT和SOD共同組成了機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)[7-8]。GSH-Px 能夠清除機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化氫和脂質(zhì)過(guò)氧化物，阻止活性氧自由基對(duì)生物體內(nèi)的損傷，確保機(jī)體正常的生命活動(dòng)[9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)第14 d 時(shí)，0.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組、1.5%和2.0%川牛膝添加組；試驗(yàn)第21 d時(shí)，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px 活性顯著高于0.5%、1.0%和1.5%川牛膝添加組，表明川牛膝對(duì)GSH-Px的影響在逐漸累積。試驗(yàn)28 d 時(shí)，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px 活性顯著高于對(duì)照組，但與其余各添加組相比差異不顯著，表明試驗(yàn)第21 d 與28 d 間淡水石斑魚血清GSH-Px 活性存在一個(gè)峰值。2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚各時(shí)間點(diǎn)的血清GSH-Px活性存在顯著差異，其中試驗(yàn)第21 d 時(shí)的血清GSH-Px 活性顯著高于試驗(yàn)第14 d 和28 d。綜上所述，川牛膝添加量為2.0%時(shí)，淡水石斑魚血清GSH-Px活性在試驗(yàn)第21 d時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)，在21 d 與28 d 之間到達(dá)峰值，之后下降；川牛膝濃度為0、0.5%、1.0%、1.5%時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的數(shù)據(jù)之間差異不顯著。結(jié)果表明，川牛膝濃度為2.0%時(shí)對(duì)淡水石斑魚血清GSH-Px活性的影響較明顯。這與唐靜[10]研究中對(duì)小鼠灌胃不同劑量的川牛膝后，T-SOD、CAT、GSH-Px 的活性和T-AOC均有不同程度的升高的試驗(yàn)結(jié)果基本吻合。

3.2 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清SOD活性的影響

SOD 別名肝蛋白，是一種內(nèi)源性抗氧化金屬酶，能夠消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基和活性氧，防止脂質(zhì)過(guò)氧化，還具有抗衰老的特殊效果[11-13]。倪青松等[14]用含不同濃度川牛膝的飼料飼喂仔雞7 d，發(fā)現(xiàn)川牛膝多糖可通過(guò)提高血清抗氧化性指標(biāo)水平提高機(jī)體的免疫能力。本試驗(yàn)中，對(duì)照組淡水石斑魚血清SOD活性隨時(shí)間推移逐漸降低，試驗(yàn)第28 d 時(shí)活性顯著低于第7 d 時(shí)。通過(guò)飼料中加入川牛膝，試驗(yàn)第28 d 時(shí)，各添加組淡水石斑魚血清SOD活性均顯著高于對(duì)照組；其中，1.0%、1.5%、2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清SOD活性的峰值均出現(xiàn)在試驗(yàn)第14 d，之后出現(xiàn)不同程度的下降，在試驗(yàn)第28 d時(shí)略有回升。與1.0%、2.0%川牛膝添加組相比，1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清SOD活性除在試驗(yàn)第7 d時(shí)略低外，在其余各時(shí)間點(diǎn)均為最高。綜上所述，川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清SOD的作用效果在試驗(yàn)第14 d時(shí)最為明顯，且川牛膝添加濃度為1.5%時(shí)效果最佳。這與玄一凡等[13]得出的在虹鱒飼料中添加2%復(fù)方中草藥能夠增強(qiáng)虹鱒幼魚血清SOD活性的研究結(jié)果相似，表明飼料中適量添加中草藥能夠提升魚類的抗氧化性能，但過(guò)量添加反而會(huì)降低魚類抗氧化性，對(duì)魚體產(chǎn)生不良影響。

3.3 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清CAT活性的影響

CAT 是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶[15]。CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過(guò)氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[15-16]。羅李媛等[17]從川牛膝中提取川牛膝多糖，測(cè)定并證實(shí)其參與了機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，從而提高機(jī)體的免疫力；川牛膝還具有促進(jìn)動(dòng)物體生長(zhǎng)發(fā)育的功能。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)第21 d 時(shí)，1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清CAT活性顯著高于試驗(yàn)第7、第14 d，說(shuō)明在添加濃度為1.5%，川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清CAT活性具有明顯的增強(qiáng)效果；試驗(yàn)第28 d時(shí)，2.0%川牛膝添加組CAT活性顯著低于其余各組，說(shuō)明淡水石斑魚血清CAT 活性在試驗(yàn)第21 d 和第28 d 之間存在一個(gè)最低值。根據(jù)這一特性，在生產(chǎn)中可根據(jù)實(shí)際需求適當(dāng)調(diào)節(jié)川牛膝的添加濃度。綜上所述，CAT對(duì)川牛膝的刺激反應(yīng)非常靈敏，但注意在實(shí)際生產(chǎn)中不宜持續(xù)性地使用川牛膝增強(qiáng)淡水石斑魚的CAT活性。

3.4 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清MDA含量的影響分

MDA 由乙醛和甲酸乙酯在堿作用下縮合而得，可在高真空下升華精制，主要用于醫(yī)藥中間體或感光色素的原料[18]。在生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，更具有潛在的致癌性[18-19]。由于動(dòng)物肉品變質(zhì)主要是由于脂類物質(zhì)的氧化，而MDA作為脂類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物，其含量可間接反映動(dòng)物脂類氧化的程度[20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試淡水石斑魚血清MDA 含量對(duì)于川牛膝的刺激在低濃度時(shí)（如0.5%、1.0%）反應(yīng)較遲緩，在試驗(yàn)第21 d時(shí)，川牛膝才開(kāi)始對(duì)MDA指標(biāo)產(chǎn)生影響。川牛膝添加濃度為1.5%和2.0%時(shí)，淡水石斑魚血清MDA含量在試驗(yàn)第7 d和第14 d時(shí)存在顯著差異。因此，在一定的范圍內(nèi)，隨著川牛膝添加濃度升高可增加魚血清MDA 的含量。試驗(yàn)第21 d 時(shí)，飼料中添加低濃度的川牛膝（如0.5%、1.0%），淡水石斑魚血清MDA 含量顯著低于對(duì)照組和其他添加組，表明較低濃度的川牛膝可在試驗(yàn)第21 d 時(shí)降低淡水石斑魚血清MDA 含量，降低魚體內(nèi)脂類的氧化程度。

3.5 川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清T-AOC的影響

T-AOC 能夠反映魚體抗氧化能力的總體表現(xiàn)，是機(jī)體防御體系中酶促及非酶促中各因子抗氧化能力的總和，可較為全面地體現(xiàn)魚體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)對(duì)外界不良因素刺激的代償能力[19]。王麗新[21]通過(guò)觀察黃芪提取液對(duì)自然衰老小鼠皮膚中T-AOC、ATP 酶活性的影響及小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)在用藥前后的變化，證明了黃芪提取液在延緩小鼠皮膚自然衰老方面的作用。本試驗(yàn)中，除2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚各時(shí)間點(diǎn)的血清T-AOC不存在顯著差異外，其余各濃度組之間均存在顯著差異；飼料中川牛膝添加濃度為1.0%時(shí)，試驗(yàn)第28 d時(shí)，淡水石斑魚血清T-AOC 最高。綜合而言，川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清T-AOC的影響效果呈波浪形。唐靜[10]給小鼠灌胃不同劑量川牛膝多糖，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的T-SOD、CAT、GSH-Px的活性和T-AOC 均有不同程度的升高，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本吻合。

4 結(jié)論

不同濃度的川牛膝作為飼料添加劑能夠?qū)Φ唪~血清抗氧化指標(biāo)產(chǎn)生影響。在各添加濃度下，川牛膝對(duì)淡水石斑魚血清GSH-Px、CAT活性在試驗(yàn)第21 d時(shí)的影響效果最明顯，而SOD 活性、MDA 含量與T-AOC 在試驗(yàn)28 d時(shí)達(dá)到最大值。研究表明，川牛膝對(duì)淡水石斑魚的抗氧化功能具有促進(jìn)作用，但每項(xiàng)抗氧化指標(biāo)的最適濃度不同；為提高其血清GSH-Px、CAT、SOD 的活性和T-AOC，降低MDA 含量，在養(yǎng)殖過(guò)程中可預(yù)先添加0.5%川牛膝，再根據(jù)實(shí)際情況適量增加川牛膝的添加濃度，以達(dá)到最優(yōu)的養(yǎng)殖效果。