人OC細胞系細胞miR-211-5p表達、轉染miR-211-5p模擬物后的增殖及遷移侵襲和EMT觀察

楊立芬，何建清，尹立新

1 唐山市婦幼保健院婦產科，河北唐山 063000；2 唐山市南湖醫院外科

卵巢癌（OC）是世界上最常見的婦科惡性腫瘤之一，早期患者經治療預后相對較好，但由于早期診斷準確率較低，大多數患者明確診斷時已經處于晚期，因此病死率較高［1］。近年來，雖然在包括手術、放化療在內的OC 治療取得了巨大進展，但OC 患者的5年生存率仍不能令人滿意［2］。因此，迫切需要探索OC 發病進展的分子機制，尋找潛在的治療靶點，以提高晚期OC 患者的生存率。SKOV3、A2780、HO8910 細胞是人OC 細胞系，為目前較常見的應用于OC 實驗研究的細胞株，其中SKOV3 是從一位OC患者的腹腔積液分離得到，廣泛應用于OC 的細胞學功能研究。研究［3-4］顯示，miRNA 的異常表達、分布與許多疾病的發病及進展密切相關，miRNA 的發現被認為給腫瘤治療帶來更好的前景。微小RNA-211-5p（miR-211-5p）是近年發現的與癌癥相關的miRNA 家族成員之一，其在許多惡性腫瘤組織和細胞中表達降低，發揮抑癌基因作用［5］。但至今miR-211-5p在OC中的研究甚少，且機制尚不明確。2022年6—12 月，我們觀察了人OC 細胞系細胞miR-211-5p 表達，以及轉染miR-211-5p 模擬物（miR-211-5p mimics）后的增殖及遷移侵襲和上皮間質轉化（EMT）。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑 人OC 細胞系SKOV3、A2780、HO8910 細胞及人正常卵巢上皮IOSE80 細胞購自美國ATCC 公司。TRIzol 抽取試劑購自美國Invitrogen 公司；Prime ScriptTM逆轉錄試劑盒、SYBR Green Master Mix 試劑盒購自日本TAKARA 公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；基質膠購自美國BD 公司；所有PCR 引物、miR-211-5p mimics、miR-NC、殼多糖酶3 樣蛋白1（CHI3L1）-wt、CHI3L1-mut購自上海吉瑪制藥公司；Lipofectamine 3000脂質體轉染試劑購自美國Thermo 公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司；CHI3L1、E-Cadherin、N-cadherin、Fibronectin、GAPDH 一抗及二抗IgG 購自美國Santa Cruz公司。

1.2 SKOV3、A2780、HO8910、IOSE80 細胞中miR-211-5p 檢測 SKOV3、A2780、HO8910、IOSE80 細胞均在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養基中培養（37 ℃、95%濕度、5%CO2環境），待細胞融合度為70%～80%時，應用胰蛋白酶消化細胞，取傳3 代的對數生長期細胞用于后續實驗。采用qRT-PCR技術檢測細胞miR-211-5p。用TRIzol 試劑提取SKOV3、A2780、HO8910、IOSE80 細胞總RNA，分光光度計檢測RNA 質量和濃度復合要求，應用Prime-ScriptTM逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄合成cDNA。以合成的cDNA 為模板，加入相關引物，應用SYBR Green Master Mix 試劑盒配置反應體系，進行擴增反應并檢測。PCR 引物序列如下：miR-211-5p 上游序列：5'-CTCGAGTAACCGTATTGTTCGCGTCATGCCAGCA-3'，下游序列：5'-GCGGCCGCCAGACCATGTGTCCCATTTG-3'；U6 上游序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR 反應條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，一共進行40 個循環。U6 作為內參基因，以2-ΔΔCt法計算miR-211-5p 的表達水平。選擇miR-211-5p 表達水平最低的OC 細胞系進行后續轉染實驗。

1.3 SKOV3 細胞分組、轉染及轉染效率檢測 取對數生長期的SKOV3 細胞，接種于6 孔板，細胞密度為1×104個/孔，根據轉染物的不同分為高表達組和對照組，高表達組SKOV3 細胞應用Lipofectamine 3000 脂質體轉染試劑將miR-211-5p 模擬物miR-211-5p mimics轉染至細胞中，對照組應用Lipofectamine 3000 脂質體轉染試劑將陰性對照miRNC 轉染至細胞中，轉染后6 h 更換培養液，轉染后24 h 收集細胞，qRT-PCR 法檢測各組細胞中miR-211-5p 水平，確定miR-211-5p 模擬物轉染效率。高表達組和對照組細胞中miR-211-5p 的表達水平分別為3.58 ± 0.29、1.01 ± 0.03，高表達組細胞中miR-211-5p 的表達水平明顯高于對照組（P<0.05），證明miR-211-5p 模擬物轉染效率較高，細胞符合后續實驗要求。

1.4 轉染miR-211-5p 模擬物的SKOV3 細胞增殖活性檢測 采用CCK-8 實驗。將SKOV3 細胞按照“1.3”所述方法分組及轉染24 h 后，收集兩組SKOV3 細胞，以5×103個/孔的細胞密度均勻接種于96 孔板，繼續培養每隔24 h 向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，繼續孵育2 h 后，用酶標儀測定450 nm處的光密度（OD）值。細胞增殖活性以OD值表示。

1.5 轉染miR-211-5p 模擬物的SKOV3 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。將SKOV3 細胞按照“1.3”所述方法分組及轉染24 h 后，收集兩組SKOV3 細胞，無血清培養基制備細胞懸液，各組取等量細胞接種至6 孔板，繼續培養細胞至鋪滿整個細胞板孔面，用規格200 μL 的無菌移液槍頭垂直于細胞板自上而下做“1”字形直線劃痕，PBS 將因劃掉的細胞沖洗干凈，加入無血清細胞培養基同樣條件下繼續培養24 h，顯微鏡下觀察并計算細胞移動距離百分比，細胞移動距離百分比=（0 h 劃痕間距-24 h 劃痕間距）/0 h 劃痕間距×100%。細胞遷移能力以細胞劃痕移動距離百分比表示。

1.6 轉染miR-211-5p 模擬物的SKOV3 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell 侵襲實驗。將SKOV3 細胞按照“1.3”所述方法分組及轉染24 h 后，收集兩組SKOV3 細胞，無血清細胞培養基重懸細胞，制備細胞密度為1×105個/mL的細胞懸液，將含20%胎牛血清的細胞培養基加入Transwell 下室，在預先包被Mgtrigel 基質膠的Transwell 上室中加入300 μL 兩組細胞懸液，繼續常規培養24 h后取出小室，去除小室膜上表面的未侵入細胞，4%甲醛固定小室膜下表面的侵入細胞，結晶紫溶液染色細胞，倒置高倍顯微鏡下觀察并計數侵入細胞的數。細胞侵襲能力以侵入細胞數表示。

1.7 轉染miR-211-5p 模擬物的SKOV3 細胞CHI3L1 及EMT 相關蛋白檢測 采用Western blotting 法檢測。將SKOV3 細胞按照“1.3”所述方法分組及轉染24 h 后，收集兩組SKOV3 細胞，RIPA 裂解細胞并提取細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。蛋白樣品行SDS-PAGE電泳（120 V，90 min），將蛋白質電轉至PVDF 膜上（50 V，120 min），將膜放置于含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h，然后加入CHI3L1抗體（1︰1 000 稀釋）、E-Cadherin 抗體（1︰2 000 稀釋）、N-Cadherin 抗體（1︰2 000 稀釋）、Fibronectin 抗體（1︰2 000 稀釋）、GAPDH 抗體（1︰10 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗IgG，室溫繼續孵育1 h，ECL 發光、顯影，拍照，Gel-Pro Analyzer 凝膠圖像處理軟件分析蛋白條帶的灰度值。蛋白的表達水平以灰度值比值表示。

1.8 miR-211-5p與CHI3L1負向調控靶向匹配關系驗證 采用雙熒光素酶報告基因實驗。將SKOV3細胞種于96 孔細胞板上，應用Lipofectamine 3000 脂質體轉染試劑將miR-211-5p mimics 或miR-NC 與CHI3L1 野生型雙熒光素酶報告載體CHI3L1-wt 或CHI3L1 突變型雙熒光素酶報告載體CHI3L1-mut 共轉染入SKOV3 細胞，轉染后細胞分為miR-211-5p mimics + CHI3L1-wt 組、miR-NC + CHI3L1-wt 組、miR-211-5p mimics + CHI3L1-mut 組、miR-NC +CHI3L1-mut 組，轉染24 h 后收集并裂解細胞，應用熒光素酶試劑盒檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.9 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人OC細胞系及正常卵巢上皮細胞miR-211-5p相對表達量比較 SKOV3、A2780、HO8910、IOSE80細胞miR-211-5p 相對表達量分別為0.56 ± 0.11、0.68± 0.13、0.64 ± 0.09、1.04 ± 0.05，SKOV3、A2780、HO8910 細胞分別與IOSE80 細胞比較（P均<0.05）。人OC 細胞系中SKOV3 細胞miR-211-5p 表達水平最低，因此選擇SKOV3 細胞進行后續實驗研究。

2.2 兩組不同時點細胞OD 值比較 不同時點細胞OD值比較見表1。

表1 兩組不同時點細胞OD值比較（± s）

表1 兩組不同時點細胞OD值比較（± s）

注：與對照組比較，*P<0.05。

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2.3 兩組細胞移動距離百分比比較 高表達組和對照組細胞移動距離百分比分別為52.4% ± 3.9%、83.6% ± 3.7%，兩組比較，P<0.05。

2.4 兩組侵入細胞數比較 高表達組和對照組侵入細胞數分別為（126 ± 21）個、（268 ± 39）個，兩組比較，P<0.05。

2.5 兩組EMT 相關蛋白灰度值比值比較 EMT 相關蛋白灰度值比值比較見表2。

表2 兩組EMT相關蛋白灰度值比值比較（± s）

表2 兩組EMT相關蛋白灰度值比值比較（± s）

注：與對照組比較，*P<0.05。

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2.6 miR-211-5p對CHI3L1的靶向匹配關系驗證結果 高表達組和對照組SKOV3 細胞中CHI3L1 蛋白表達水平分別為0.33 ± 0.08、0.68 ± 0.11，兩組比較，P<0.05。miR-211-5p mimics + CHI3L1-wt 組、miR-NC + CHI3L1-wt組、miR-211-5p mimics + CHI3L1-mut組、miR-NC + CHI3L1-mut 組細胞相對熒光素酶活性分別為0.44 ± 0.08、0.98 ± 0.04、0.99 ± 0.03、1.02 ± 0.04，miR-211-5p mimics + CHI3L1-wt 組和miR-NC + CHI3L1-wt組比較，P<0.05。

3 討論

OC是全球女性相關死亡的主要原因之一，常見于50 歲以上的女性，其發病率在婦科惡性腫瘤中排名第4，病死率在婦科癌癥中排名第二，并且近年來其發病率有上升趨勢，是目前世界范圍內嚴重影響女性健康和生命的常見婦科惡性腫瘤。手術、化療和放療是目前OC 最常見的傳統治療方法，但由于OC早期缺乏特異性癥狀，很多患者確診時已經處于晚期，目前的診療方法效果較差，患者預后不能令人滿意。SKOV3、A2780、HO8910 細胞是目前較常應用于OC 實驗研究的細胞株，其中SKOV3 是從一位OC 患者的腹腔積液分離得到，是良好轉染宿主細胞，適合OC 的細胞學功能研究。OC 的發生和進展是一個復雜而漸進的過程，與基因突變和信號通路異常等多種因素有關。隨著基礎和臨床研究的進展，人們對OC 的發展和進展機制有了更深入的了解，但近幾十年來OC 患者的生存和預后并沒有明顯改善。因此，OC患者的治療仍然是一個重大的臨床挑戰，尚需要在分子水平上對腫瘤發生和新療法進行進一步研究。

miRNA 是一種長度為20～22 個核苷酸非編碼單鏈RNA，在進化上具有高度保守性，能夠調控下游靶基因的翻譯或轉錄，可以調節細胞分化、凋亡和增殖等生命活動，參與機體的生理病理活動［6］。近年來越來越多的轉錄組學和基因組學研究證據表明，miRNA 的異常表達與OC 腫瘤發生之間存在相關性［7］。DIRIMTEKIN 等［8］報道，miR-34a 可能作為提高OC 早期診斷效率的潛在生物學標志物，并且過表達miR-34a 可能通過靶向FOXP1 來抑制OC 的發病及進展。miR-590-5p 被發現通過靶向hMSH2基因促進OC 對順鉑的耐藥性［9］。miR-211-5p 是近期發現的腫瘤相關miRNA 家族重要成員之一，研究發現其在膀胱癌［10］、腎癌［11］、甲狀腺癌［12］、肝細胞癌［13］等多種惡性腫瘤中均表達異常，可能參與腫瘤的發生進展。近年來研究［14-15］顯示，miR-211-5p 在調控惡性腫瘤EMT 過程中發揮著重要作用。EMT過程是上皮細胞喪失上皮特性，獲得間充質表型的過程，是腫瘤細胞獲得生長及轉移等腫瘤惡性表型的關鍵過程，為惡性腫瘤發生進展的重要環節［16］。并且近期研究發現，miR-211-5p 能夠靶向調控CHI3L1 基因表達從而調節腫瘤細胞的生物學行為［17］。CHI3L1 是一種分泌型糖蛋白，位于人1 號染色體q32 的高度保守區域。近期研究［18-20］表明，CHI3L1在包括OC在內的眾多腫瘤中表達異常高表達，并且其高表達與患者轉移、化療藥物抵抗及不良預后有關。LIN 等［21］發現OC 患者CHI3L1 高表達與患者的不良結局和化療耐藥性相關，CHI3L1顯著增強OC 細胞的干細胞特性。較多的既往研究及本課題組前期研究結果已證實，抑制CHI3L1表達能夠抑制OC 細胞的增殖、遷移、侵襲、EMT 及腫瘤血管生成［22-24］。從以上研究結果可以看出，miR-211-5p 在多種腫瘤發生和發展過程中調控著腫瘤細胞的生物學功能，而且其對腫瘤細胞的生物學功能的調控可能與靶向調控CHI3L1有關。但至今，miR-211-5p在OC中的研究較少，并且作用機制尚不清楚。

本研究顯示，miR-211-5p 在SKOV3、A2780、HO8910 細胞中的表達水平明顯低于IOSE80 細胞，提示miR-211-5p 可能在OC 的發生發展過程中起著抑癌基因的作用；本研究還發現，上調SKOV3 細胞miR-211-5p 表達后，細胞增殖、遷移、侵襲能力均被明顯抑制，進一步說明miR-211-5p 作為抑癌基因在OC 的發生發展過程中發揮作用；上調SKOV3 細胞miR-211-5p 表達后，SKOV3 細胞上皮源性標志物E-Cadherin 蛋白的表達明顯升高，而間質源性標志物N-Cadherin 和Fibronectin 蛋白的表達水平明顯降低，說明高表達miR-211-5p 能抑制SKOV3 細胞的EMT過程；進一步發現，上調SKOV3細胞miR-211-5p表達后，SKOV3 細胞中CHI3L1 蛋白的表達明顯降低；miR-211-5p可以與CHI3L1的3'UTR 區特異性結合從而使其熒光素酶活性明顯降低，證明miR-211-5p對CHI3L1 存在靶向調控關系；提示miR-211-5p對SKOV3 細胞增殖、遷移、侵襲及EMT 等腫瘤生物學特性的影響，可能與其對CHI3L1基因的靶向調控有關。

總之，miR-211-5p 在OC 細胞系中表達降低，高表達miR-211-5p 可抑制SKOV3 增殖、遷移、侵襲及EMT，其機制是通過負向調控CHI3L1表達實現的。