急性淋巴細(xì)胞白血病患者外周血濾泡輔助性T細(xì)胞亞群比例、血清細(xì)胞因子水平變化及其相關(guān)性

張冉冉，龔珊，張瑞，張淋一，張曼姁，曲建華

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心，烏魯木齊 830054

急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）是一種發(fā)生在B細(xì)胞或者T 細(xì)胞的未成熟淋巴細(xì)胞的腫瘤性疾病，主要病理表現(xiàn)為大量原始細(xì)胞聚集在骨髓內(nèi)，破壞骨髓正常的造血，而產(chǎn)生一系列的癥狀，包括貧血、出血、感染等［1］。在標(biāo)準(zhǔn)化療過程中，ALL 容易產(chǎn)生耐藥性和復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后的治療會(huì)引起各種并發(fā)癥，導(dǎo)致患者的存活率顯著降低，使治療充滿挑戰(zhàn)，尋找新的、不良反應(yīng)少、患者能耐受的治療方法是目前臨床上亟待解決的關(guān)鍵問題［2］。T 淋巴細(xì)胞亞群在體液免疫和細(xì)胞免疫方面發(fā)揮重要作用，其亞群比例平衡偏移可能導(dǎo)致免疫監(jiān)視功能異常，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)，接受免疫化療的ALL 患者出現(xiàn)輔助性T 細(xì)胞1 型（Th1）數(shù)量升高、輔助性T 細(xì)胞2 型（Th2）及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）數(shù)量減低，提示免疫化療治療影響ALL 患者T 細(xì)胞，尤其是CD4+T 細(xì)胞，可能導(dǎo)致機(jī)體免疫功能障礙。Tfh1 分泌Th1 型細(xì)胞因子干擾素-γ（IFNγ），Tfh2 分泌Th2 型細(xì)胞因子IL-γ，Tfh17 分泌Th17細(xì)胞因子IL-17。目前，關(guān)于ALL 患者Tfh 亞群及細(xì)胞因子之間的作用關(guān)系尚不明確，國(guó)內(nèi)鮮有相關(guān)報(bào)道［5-10］。2022 年5 月—2023 年6 月，我們觀察了ALL外周血Tfh 亞群比例、血清細(xì)胞因子水平變化，并分析兩者間及其與患者預(yù)后的關(guān)系，旨在為ALL 的免疫治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2022 年5 月—2023 年6 月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的初次確診未經(jīng)治療的ALL 患者30 例（觀察組），男18 例，女12 例；中位年齡43.00（21.75，58.00）歲；所有患者均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)分型明確診斷，排除慢性淋巴細(xì)胞白血病的急淋變及既往有相關(guān)自身免疫性疾病、感染、腫瘤病史的患者，符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。觀察組再根據(jù)ALL 患者預(yù)后危險(xiǎn)分層標(biāo)準(zhǔn)［11］分為預(yù)后良好者［13例，年齡<35 歲，初診WBC<30×109/L（B-ALL）或<100×109/L（T-ALL），早期達(dá)完全緩解（CR）且CR 后MRD 陰性/<10-4］和預(yù)后不良者［17 例，年齡≥35歲，初診WBC≥30×109/L（B-ALL）或≥100×109/L（T-ALL），達(dá)CR 時(shí)間超過4周且CR 后MRD 陽(yáng)性/≥10-4］。另選取同期健康體檢者20 例（對(duì)照組），男10 例，女10 例；中位年齡48.5（37.75，58.00）歲。兩組一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。本研究獲得新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：K202306-11），受試者均知情同意。

1.2 外周血Tfh 比例、血清細(xì)胞因子測(cè)算 分別采集觀察組和對(duì)照組空腹外周靜脈血4 mL，置于肝素鈉抗凝試管中，顛倒混勻后靜置，于2 h 內(nèi)送檢。采集好的外周血經(jīng)室溫150 g 離心5 min，收集上層血清，立即凍存于-80 ℃冰箱，備用。①外周血Tfh 亞群：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取存有4 mL 新鮮外周血的 肝素鈉抗凝管，標(biāo)記所有受試者序號(hào)，在流式管壁上標(biāo)記相對(duì)應(yīng)序號(hào)，準(zhǔn)備需要的抗體。吸取100 μL 外周血置于相同編號(hào)的流式管內(nèi)，分別加入抗體CD4-FITC、CXCR3-PE/Dazzle、CCR6-PerCP/Cyanine5.5、CXCR5-PE 各1 μL，在避光環(huán)境下溫育20 min；后加入1 mL 溶血?jiǎng)┗靹颍诒芄猸h(huán)境下靜置20 min；隨后經(jīng)150 g 下離心5 min，倒去上清；加入2 mL 的PBS 溶液混勻，經(jīng)150 g 下離心5 min，隨后加入PBS 溶液300 μL 混勻重懸細(xì)胞，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)Tfh（CD4+CXCR5+）、Tfh1（CD4+CXCR5+CXCR3+CCR6-）、Tfh2（CD4+CXCR5+CXCR3-CCR6-）及Tfh7（CD4+CXCR5+CXCR3-CCR6+） 的細(xì)胞比例，獲取數(shù)據(jù)后，應(yīng)用FlowJo軟件分析。②血清IFN-γ、IL-4、IL-17：采用ELISA法檢測(cè)。將血清標(biāo)本放置室溫解凍，同時(shí)將Human IFN-γ、IL-4、IL-17的ELISA 試劑盒提前放至室溫平衡20 min；在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，加入不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，并設(shè)空白孔及待測(cè)孔；在待測(cè)孔中加待測(cè)樣品40 μL，再加抗IFN-γ、IL-4、IL-17抗體各10 μL，晃動(dòng)混勻，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外；再加入100 μL 過氧化物酶工作液，封板，37 ℃孵育1 h，棄去液體并甩干，洗板5 次，每孔加入100 μL 的底物溶液，37 ℃孵育15 min，50 μL 終止溶液終止反應(yīng)，檢測(cè)每孔450 nm 吸光度，根據(jù)測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)品濃度以及對(duì)應(yīng)的OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出血清IFN-γ、IL-4、IL-17。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以xˉ ± s 表示，比較采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血Tfh 亞群比例比較 外周血Tfh 亞群比例比較見表1。

表1 兩組外周血Tfh亞群比例比較（%，± s）

表1 兩組外周血Tfh亞群比例比較（%，± s）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與預(yù)后不良者比較，bP<0.05。

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2.2 兩組血清IFN-γ、IL-4、IL-17 水平比較 血清IFN-γ、IL-4、IL-17水平比較見表2。

表2 兩組血清IFN-γ、IL-4、IL-17水平比較（ng/L，± s）

表2 兩組血清IFN-γ、IL-4、IL-17水平比較（ng/L，± s）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與預(yù)后不良者比較，bP<0.05。

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2.3 觀察組外周血Tfh 亞群比例與血清細(xì)胞因子的相關(guān)性 觀察組Tfh、Tfh2 比例與ALL 患者血清IL-4 水平呈正相關(guān)（r分別為0.860、0.965，P均<0.05），Tfh 比例與血清IFN-γ 水平呈負(fù)相關(guān)（r為-0.289，P<0.05）。

3 討論

ALL 是一種惡性造血系統(tǒng)腫瘤，其能夠浸潤(rùn)到骨髓、血液或其他器官和組織中，引起骨髓造血功能障礙和免疫功能障礙。ALL起病急，發(fā)展迅速，具有很高的異質(zhì)性，因其發(fā)病機(jī)制及病因的復(fù)雜性，患者預(yù)后較差，平均生存期僅3 個(gè)月［12-13］。現(xiàn)階段AL 的主要治療包括化學(xué)治療及造血干細(xì)胞移植等方法，盡管隨著化療方案的優(yōu)化及造血干細(xì)胞移植技術(shù)的提升，在一定程度上ALL 患者的緩解率及生存時(shí)間有所延長(zhǎng)，但是仍有部分的患者因疾病復(fù)發(fā)或難治而死亡［14］。近年來，不斷研究和發(fā)展的免疫療法成為一種具有潛力治療手段，可提高ALL 的精準(zhǔn)靶向診療。

隨著對(duì)ALL 疾病不斷深入研究，已證實(shí)免疫功能紊亂與ALL 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。在抗腫瘤免疫中，淋巴細(xì)胞具有重要的作用，T 細(xì)胞亞群之間通過相互協(xié)調(diào)、相互拮抗來維持免疫應(yīng)答的相對(duì)平衡，研究發(fā)現(xiàn)的 T 細(xì)胞亞群的失調(diào)和平衡紊亂參與了ALL疾病進(jìn)展［3-4，15］。這些年，在免疫學(xué)領(lǐng)域，新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群Tfh細(xì)胞越來越受到重視，它搭起人體的細(xì)胞免疫和體液免疫的橋梁作用［16］。Tfh 細(xì)胞是一種不同于Th1、Th2 和Treg 細(xì)胞的CD4+T 細(xì)胞新亞群，主要定位于B 淋巴濾泡，輔助初始B 細(xì)胞增殖分化成熟、抗體類別轉(zhuǎn)換及分泌，促進(jìn)生發(fā)中心形成。已有研究［17］表明，B細(xì)胞淋巴瘤患者Tfh細(xì)胞數(shù)量增多，過度活化的Tfh 細(xì)胞，通過分泌如腫瘤壞死因子α、IL-4 及IL-21 等細(xì)胞因子可能改變腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃逸。最近的一項(xiàng)研究表明，CLL患者Tfh 細(xì)胞的增加與臨床分期和腫瘤負(fù)荷有關(guān)，提示Tfh 在CLL 發(fā)病機(jī)制中起重要作用，特別是Tfh1細(xì)胞水平升高，與腫瘤負(fù)荷相關(guān)性更強(qiáng)，進(jìn)而參與了疾病的進(jìn)展［18］。ZHOU 等［10］研究學(xué)者報(bào)道，初診治療前ALL 患者外周血中Tfh 細(xì)胞水平明顯高于健康對(duì)照組，而在誘導(dǎo)化療2、4、6個(gè)療程后，緩解者Tfh 水平呈下降趨勢(shì)，至第6 個(gè)療程末，接近甚至低于健康人，這提示Tfh 過度活化與ALL 疾病進(jìn)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，觀察組外周血Tfh 和Tfh2 比例明顯增加，Tfh1 比例降低，這表明ALL患者存在免疫功能紊亂，Tfh亞群的變化可能與疾病的發(fā)病有關(guān)。本研究還顯示，觀察組預(yù)后不良者較良好者Tfh、Tfh2 比例明顯增高，而Tfh1 比例無明顯差異。提示Tfh 表達(dá)量隨著ALL 患者危險(xiǎn)度進(jìn)展不斷升高，患者體內(nèi)存在Tfh2 比例升高，Tfh1 比例降低，導(dǎo)致Tfh1/Tfh2比例失衡，且平衡偏向Tfh2，這表明Tfh 可能增強(qiáng)免疫抑制作用，特別是Tfh2 發(fā)揮主導(dǎo)作用，促進(jìn)了疾病的進(jìn)展。

細(xì)胞因子的失衡有助于抑制免疫應(yīng)答，對(duì)于逃避免疫監(jiān)視至關(guān)重要。IFN-γ 是一種主要由T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)和效應(yīng)細(xì)胞因子，在腫瘤微環(huán)境中，其是腫瘤免疫監(jiān)測(cè)的重要參與者，包括抗增殖、抗血管生成和促凋亡等作用［19］。IL-4 是一種多效性的細(xì)胞因子，對(duì)B 細(xì)胞的活化、增殖、分化等不同階段都發(fā)揮重要的作用，其可以下調(diào)Th1細(xì)胞，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。低水平的IFN-γ 可以活化自然殺傷細(xì)胞的活化和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞，降低腫瘤抗原的識(shí)別能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生逃避，還能作用于CD8+T細(xì)胞，減弱其對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，增加抑制免疫細(xì)胞的產(chǎn)生［20］。楊志剛等［4］學(xué)者檢測(cè)了初診急性白血病患者中血清中IFN-γ 和IL-4，發(fā)現(xiàn)ALL患者血清IL-4 水平升高，IFN-γ 水平降低，并檢測(cè)到ALL 患者機(jī)體存在Th1/Th2 比例失衡，使免疫微環(huán)境處于抑制狀態(tài)，不利于抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致白血病細(xì)胞逃逸。本研究同樣檢測(cè)觀察組血清中IFN-γ 和IL-4 水平，并得出了一致的結(jié)論；在不同預(yù)后分層者中，還發(fā)現(xiàn)在預(yù)后不良者血清中IL-4 水平更高和IFN-γ 水平更低。故推測(cè)在ALL 疾病惡性進(jìn)展過程中，大量炎癥細(xì)胞及免疫細(xì)胞被活化，高水平的IL-4 和低水平的IFN-γ 導(dǎo)致ALL 患者免疫微環(huán)境紊亂，使CD4+Th 細(xì)胞向Tfh 分化、增殖。而Tfh 數(shù)量的增多，使機(jī)體免疫功能發(fā)生改變，可能誘導(dǎo)疾病的發(fā)生。為了進(jìn)一步研究ALL 疾病進(jìn)展中免疫與炎癥因素的關(guān)系，我們分析了ALL患者血清IFN-γ、IL-4與Tfh 亞群的相關(guān)性，結(jié)果顯示Tfh、Tfh2 與ALL 患者血清IL-4 呈正相關(guān)，且與Tfh2 的相關(guān)性更強(qiáng)，Tfh與血清中IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，血清IL-4水平升高與外周血的Tfh2 密切相關(guān)，推測(cè)IL-4 由Tfh2 產(chǎn)生，而IFN-γ 與Tfh1 沒有相關(guān)性，推測(cè)IFN-γ細(xì)胞因子不僅來自Tfh1，還可能來自其他免疫細(xì)胞，如Th1細(xì)胞。提示ALL 患者體內(nèi)高水平IL-4和低水平IFN-γ，導(dǎo)致Tfh1/Tfh2免疫平衡發(fā)生變化，增多的Tfh2 通過分泌大量IL-4，抑制IFN-γ 的產(chǎn)生及Tfh1的活化，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)下調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。

總之，ALL 患者外周血Tfh 及Tfh2 比例增加和Tfh1 比例減小，血清IFN-γ 水平降低和IL-4 水平升高，其與患者預(yù)后不良有一定的關(guān)系，可能參與了ALL的免疫功能紊亂，并且增強(qiáng)了免疫抑制作用，參與了疾病進(jìn)展。