降糖舒心方混懸液灌胃對大鼠糖尿病心力衰竭的治療作用及其機制

蔣曉鳳，陳佳俊，黃光明，申亞亞，符顯昭

1 右江民族醫學院臨床醫學院，廣西百色 533000；2 右江民族醫學院附屬醫院康復醫學科；3 右江民族醫學院附屬醫院中醫科

糖尿病（DM）是一組由遺傳因素和環境因素共同引起的代謝性疾病，隨著生活方式的改變以及人口老齡化的加快，DM 的患病率呈上升趨勢，據世界衛生組織預測，到2030 年DM 將成為第七大死亡原因［1］。研究［2］表明，DM 是心力衰竭（HF）的獨立危險因素，使患HF 的風險增加2～5 倍。DM 引起HF 的病因病機包括高血糖、高血脂、炎癥反應、心臟自主神經失調等［3］。目前，針對DHF的治療尚無特效藥，西藥治療主要集中在降糖方面，通過控制血糖緩解疾病，但西藥治療存在較多不良反應，存在容易產生藥物依賴性等缺點。中藥治療具有多靶點、多途徑和不良反應相對較小的優勢，因此探索中醫藥治療DHF具有重要意義。降糖舒心方具有“滋陰益氣、活血解毒”的作用，可改善DM 代謝紊亂，提高抗氧化應激能力，通過抑制內質網應激凋亡通路緩解心肌細胞凋亡，對DM 大鼠心肌損傷具有保護作用［4］。2022 年7 月—2023 年2 月，我們觀察了降糖舒心方混懸液灌胃對大鼠DHF 的治療作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD 雄性大鼠50 只，體質量（230 ±10）g，購自廣西醫科大學實驗動物中心，許可證編號為SCXK（桂）2014-002。飼養于右江民族醫學院動物實驗中心，溫度（23 ± 2）℃，濕度45%～60%，光照/黑暗各12 h循環，適應性喂養7 d。

1.2 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素（北京華越洋生物公司），血糖測試儀（上海玉研科學儀器有限公司），高脂飼料（江蘇省協同生物工程有限公司），格列喹酮（北京萬輝雙鶴藥業有限責任公司），貝那普利（北京諾華制藥有限公司），CRP、IL-6、TNF-α試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），LDH、CK-MB檢測試劑盒（南京建成科技有限公司），HE 染色試劑盒（碧云天生物技術有限公司），Western blot 試劑盒（武漢三鷹有限公司），全自動生化儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司），酶標儀（深圳市匯松科技發展有限公司），光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司），凝膠成像系統（廣州市科之藍儀器公司）。

1.3 降糖舒心方浸膏制備 取人參10 g、麥冬12 g、五味子10 g、黃芪18 g、生地15 g、山藥15 g、山茱萸10 g、大黃5 g、黃連8 g、丹參12 g，浸泡半小時，煎煮1.5h，將濃縮藥液轉移至烘干箱中，90 ℃烘干36 h，制成浸膏，每1 g 相當于原生藥10 g，滅菌后保鮮膜密封放入-20 ℃冰箱保存。

1.4 實驗動物分組、DHF 模型制備及降糖舒心方混懸液灌胃方法 將50 只SD 大鼠隨機分為5 組各10 只，低劑量組、高劑量組、西藥組、模型組制備DHF模型，對照組不制備DHF模型。DHF模型制備方法：低劑量組、高劑量組、西藥組、模型組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg，72 h 后檢測大鼠空腹血糖值，連續兩次FBG≥16.7 mmol/L 表明DM 大鼠造模成功。隨后DM 大鼠禁食12 h，不禁水。HF 的制模方法參照文獻［5］，腹腔注射8%戊巴比妥鈉2 mL/kg，麻醉DM 大鼠，打開腹腔，暴露腹主動脈，在腹主動脈上放置7 號針，用手術線結扎腹主動脈和7 號針，然后將7 號針拔出，縮窄腹主動脈60%～70%，術后進行3 天青霉素腹腔注射抗感染治療。8周后進行超聲檢查大鼠左室射血分數（LVEF），LVEF<45%即為DHF模型建立成功。室溫下解凍浸膏，將其至于EP管中，加入生理鹽水，經渦旋震蕩配置成2 mL 混懸液。低劑量組灌胃給予1.0 g/（kg·d）的降糖舒心方混懸液，高劑量組灌胃給予1.5 g/（kg·d）的降糖舒心方混懸液，西藥組灌胃給予格列喹酮和貝那普利（二藥配成等體積溶液），連續灌胃2個月，高脂飼料喂養；對照組給予普通飼料喂養。

1.5 大鼠FBG及血清TG、LDL-C、HDL-C、CRP、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH 檢測 每組取10 只大鼠，末次給藥后，禁食12 h，可飲水，用8%戊巴比妥鈉，按照2 mL/kg 麻醉大鼠，用注射器抽取腹主動脈血，4 ℃低溫靜置后，3 000 r/min 離心15 min，取上清。分裝、標記后置于-80 ℃冰箱。采用血糖測試儀檢測FBG，全自動生化儀測定血清TG、LDL-C、HDL-C，按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清CK-MB、LDH、CRP、IL-6、TNF-α。

1.6 大鼠心肌組織病理形態觀察 采用HE 染色方法。“1.5”中的大鼠取血完成后處死，冰上迅速進行心臟取材，0.9%氯化鈉溶液漂洗，洗凈血液，濾紙擦干，一部分用于HE 染色，即心肌組織按4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，厚度為4 μm，切片經二甲苯、無水乙醇和95%、80%、70%乙醇依次處理后，經蘇木精染液浸染5 min，自來水沖洗約1～2 min，1%HCI 溶液分化10 s，自來水沖洗藍化10～30 min，伊紅浸染2～5 min；再次進行梯度酒精、二甲苯脫水、透明，最后中性樹膠封片，每只大鼠取3張切片，每張切片隨機選取5 個視野在顯微鏡下觀察；細胞核呈藍色，細胞質、肌纖維、膠原纖維等呈深淺不同的紅色。另一部分，用眼科剪剪碎心肌組織，用RIPA 裂解液提取蛋白，定量、分裝、標記后置于-80 ℃冰箱，用于蛋白的測定。

1.7 大鼠心肌組織NF-κB p65、IκBα 蛋白檢測采用Western blot 法。取“1.6”中的另一部分心肌組織，充分裂解勻漿后，在冰上靜置0.5 h，用離心機以12 000 r/min 速度離心15 min，取上清，準備蛋白標準品、配置BCA 工作液進行蛋白含量測定，將50 μg 蛋白樣品上樣，進行SDS-PAGE 電泳和轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，先于一抗4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次，再進行二抗孵育1～2 h，TBST 清洗3 次，加入ECL 顯影液進行顯影，以GAPDH 為內參，用Image J 軟件分析膜上目的蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS24.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠FBG 及血清TG、LDL-C、HDL-C 水平比較 大鼠FBG 及血清TG、LDL-C、HDL-C 水平比較見表1。

表1 各組FBG及血清TG、LDL-C、HDL-C水平比較（mmol/L，± s）

表1 各組FBG及血清TG、LDL-C、HDL-C水平比較（mmol/L，± s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05。

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2.2 各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較 大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較見表2。

表2 各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較（± s）

表2 各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較（± s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05。

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2.3 各組大鼠血清CK-MB、LDH 水平比較 大鼠血清CK-MB、LDH水平比較見表3。

表3 各組大鼠血清CK-MB、LDH水平比較（U/L，± s）

表3 各組大鼠血清CK-MB、LDH水平比較（U/L，± s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05。

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2.4 各組大鼠心肌組織病理形態比較 對照組大鼠心肌組織心肌細胞形態正常，排列整齊，細胞間隙正常，邊界清晰，未見明顯的炎細胞及纖維化；與對照組比較，模型組大鼠心肌組織損傷嚴重，心肌細胞排列雜亂無序，細胞腫脹和壞死，間隙模糊，部分可見炎性細胞聚集；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、西藥組大鼠心肌損害均不同程度緩解，其中高劑量組大鼠心肌損害程度明顯降低，心肌細胞形態較正常，炎癥細胞浸潤明顯減輕，心肌細胞排列較整齊。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態比較（×400）

2.5 各組大鼠心肌組織NF-κB p65、IκBα 蛋白表達比較 大鼠心肌組織NF-κB p65、IκBα 蛋白表達比較見表4。

表4 各組大鼠心肌組織NF-κB p65、IκBα蛋白表達比較（± s）

表4 各組大鼠心肌組織NF-κB p65、IκBα蛋白表達比較（± s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

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3 討論

研究［6］表明，DM 會增加患心血管疾病的風險，約為非DM 人群的2.5 倍。HF 是DM 心血管并發癥之一，是由多種原因導致心臟結構和（或）功能的異常改變，使心室收縮和（或）舒張功能發生障礙，從而引起的一組復雜臨床綜合征，代表了大多數心血管疾病的終末階段，主要表現為呼吸困難、疲勞、和液體潴留（肺淤血、體循環淤血及外周水腫）等［7］。研究［8］發現，DM 引起心肌損害導致HF 的發生其演變過程包括三個階段，第一階段無明顯臨床癥狀，其特征為代謝信號傳導受損和心臟能量利用改變；第二階段通過臨床影像學檢查可發現左心室肥厚、心肌纖維化等心肌結構重塑表現，無典型的HF 癥狀；第三階段出現收縮功能障礙及明顯的心衰癥狀。目前，臨床上用于治療DHF 的降糖藥物如噻唑烷二酮類、磺酰脲類、胰島素等可降低血糖，但同時可引發和加重HF的發展［9］，由此可知西藥干預DHF具有局限性。中醫藥在中醫理論的指導下，具有多方面、多層次的調節作用，因此探索中醫藥治療DHF 具有重要意義。

降糖舒心方由黃芪、人參、地黃、麥冬、山茱萸、丹參、大黃、黃連、五味子、山藥等中藥組成，其中人參、麥冬、五味子是生脈散成分，山藥、山茱萸、地黃是左歸丸成分，兩方皆為補益方劑，具有補腎陰、補心氣、滋陰生津的作用；大黃、黃連是泄心湯的主要成分，具有清熱解毒的功效，丹參清心除煩、活血化瘀，黃芪健脾補氣、益衛固表，全方滋陰益氣、活血解毒、扶正祛邪、攻補兼施［10］。DM 狀態下，可出現高糖、高脂表現，本次研究發現模型組中FBG、TG、LDL-C 水平升高，HDL-C 水平下降，與DM 的一般表現相符。文獻［11-12］報道，CRP、IL-6、TNF-α 炎癥因子反應體內炎癥水平，其水平增加可誘導并反映DM 大鼠心肌損傷。CK-MB、LDH 是心肌損傷標志物，與心肌損傷呈正相關［13］。

本研究顯示，與對照組比較，其余4 組大鼠FBG及血清TG、LDL-C、CRP、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH水平升高，血清HDL-C 水平下降，心肌組織損傷嚴重；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、西藥組FBG及血清TG、LDL-C、CRP、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH水平下降，血清HDL-C 水平升高，心肌組織損傷減輕；與西藥組比較，高劑量組FBG及血清TG、LDL-C、CRP、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH 水平下降，血清HDL-C 水平升高，心肌組織損傷減輕。表明降糖舒心方具有改善DHF 大鼠高糖、高脂狀態、減輕炎癥反應、緩解心肌損害的作用，其中高劑量組的治療效果優于西藥組。

核轉錄因子NF-κB由兩個亞基p50和p65組成，是炎癥反應的關鍵介質，靜息狀態下IκB 蛋白與二聚體NF-κB 緊密結合，阻止NF-κB 與DNA 結合，使其處于失活狀態［14-15］。研究［16］表明，DM 狀態下高血糖、高血脂、晚期糖基化終產物、氧化應激、炎癥因子等可通過經典途徑和非經典途徑激活NF-κB信號通路，NF-κB 的激活可誘導內皮功能障礙、心肌纖維化、肥大、細胞凋亡，促進糖尿病心肌病（DCM）的發生。WANG等［17］通過對1型糖尿病（T1DM）小鼠心臟組織進行RNA 測序和KEGG 富集分析，發現NF-κB信號通路在T1DM 模型中表達上調，基于這些結果，利用Western blot 檢測小鼠心臟組織中NF-κB P65和IκBα 的蛋白表達，結果標明NF-κB P65 蛋白表達升高，IκBα 蛋白表達下降，抑制NF-κB 信號通路的活化，可減輕炎癥反應，減輕DCM 的心臟肥大、纖維化。同樣的結果在高脂飼養的2 型糖尿病模型和高糖處理的H9c2 細胞中也得到了證實。張弛等［18］通過體內體外實驗亦證實鳶尾素通過抑制NF-κB信號通路的活化，可發揮保護DM 心肌損傷的作用。由此可知，NF-κB 信號通路在DM 心臟病中扮演重要角色。本研究顯示，與對照組比較，NF-κB p65 蛋白表達升高，IκBα 蛋白表達下降；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、西藥組NF-κB p65 蛋白表達下降，IκBα 蛋白表達升高；表明降糖舒心方能夠抑制NF-κB 信號通路，進而改善DHF大鼠的心肌損傷。總之，降糖舒心方具有降糖、降脂、減輕炎癥反應，改善心肌損傷，對DHF 具有治療作用，其機制可能為抑制NF-κB信號通路有關。