6%噻唑膦·氨基寡糖素水乳劑配方研制及應(yīng)用

范樹茂，司國(guó)棟，張坤，秦玉坤，趙顯棟，王磊，隋書婷

(1.海利爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,山東 青島 266109；2.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，山東 青島；3.青島奧迪斯生物科技有限公司,山東 青島 266109)

水乳劑(EW)是一種以水為分散介質(zhì)的水基化制劑，毒性低，對(duì)環(huán)境污染小，并具有較高的藥效，是取代傳統(tǒng)劑型，尤其是乳油產(chǎn)品的最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的劑型之一。因水乳劑高效[1]，與環(huán)境相容、對(duì)植物毒性低以及施藥方便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛推廣應(yīng)用，但是作為熱力學(xué)不穩(wěn)定分散體系，水乳劑是農(nóng)藥制劑發(fā)展中發(fā)展歷史較短，并處于不斷完善的一種新劑型。

噻唑膦是20 世紀(jì)90 年代由日本石原推出，主要作用機(jī)制為抑制根結(jié)線蟲乙酰膽堿酯酶的合成，可用于防治多種根結(jié)線蟲，具有觸殺和內(nèi)吸作用，速效性好，持效期長(zhǎng)。氨基寡糖素是指D-氨基葡萄糖以β-1,4 糖苷鍵連接的低聚糖，由幾丁質(zhì)降解為殼聚糖后再降解制得，或由微生物發(fā)酵提取的低毒殺菌劑。氨基寡糖素對(duì)一些病菌的生長(zhǎng)有抑制作用，可影響真菌孢子萌發(fā)，誘發(fā)菌絲形態(tài)發(fā)生變異、孢內(nèi)生化發(fā)生改變等。它能誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生具有抗病作用的幾丁酶、葡聚糖酶、植保素及PR 蛋白等，并具有細(xì)胞活化作用，有助于受害植株的恢復(fù)，促根壯苗，增強(qiáng)作物的抗逆性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育。

本文通過篩選溶劑、乳化劑以及生測(cè)試驗(yàn)，研究氨基寡糖素和噻唑膦水乳劑配方復(fù)配，以及氨基寡糖素對(duì)噻唑膦的增效作用，以期為該產(chǎn)品的生產(chǎn)及應(yīng)用推廣提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

原藥：95%噻唑膦(河北四面體生物科技有限公司)，90%氨基寡糖素(山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司)；溶劑：二甲苯、S-150、S-200(山東賽爾化工科技發(fā)展有限公司)；乳化劑：蓖麻油聚氧乙烯醚[EL360，科萊恩化工(中國(guó))有限公司]，三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯鹽(SC，Solvay 集團(tuán))，三苯乙烯基聚氧乙烯醚(農(nóng)乳600#)、三苯乙烯基酚聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物(農(nóng)乳34#)、失水山梨醇聚氧乙烯醚(Tween 80) (江蘇鐘山化工有限公司)，EO-PO 嵌段共聚物(500LQ，阿克蘇諾貝爾公司)；防凍劑：丙三醇、丙二醇、乙二醇(臨淄雙洋福利油脂有限公司)；去離子水。

1.2 儀器

高速剪切分散乳化機(jī)FA25(上海弗魯克科技發(fā)展有限公司)；激光粒徑測(cè)定儀Mastersizer3000(馬爾文帕納科公司)；Cary 60 UV-Vis 分光光度計(jì)(安捷倫科技有限公司)；1260 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；電子天平XPR2004SC(梅特勒-托利多集團(tuán))；電熱恒溫干燥箱PH010(上海一恒科技有限公司)，電恒溫油浴鍋SM-150(南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水乳劑的制備

首先將噻唑膦、溶劑、乳化劑和抗分解劑按照配方要求制備成油相，然后將氨基寡糖素、防凍劑和去離子水按照配方要求制備成水相。直乳法：開啟轉(zhuǎn)速在10 000 r/min 條件下的剪切機(jī)，把油相加到水相中，進(jìn)行剪切乳化，即得到直乳法制備的水乳劑；轉(zhuǎn)相法：在同樣的剪切條件下，將水相緩慢加入到油相中，進(jìn)行剪切乳化，即得到轉(zhuǎn)相法制備的水乳劑。

1.3.2 質(zhì)量控制指標(biāo)測(cè)定

氨基寡糖素的檢測(cè)按照《氨基寡糖素第1 部分：氨基寡糖素母藥》(NYT 2889.1—2016)中分光光度法進(jìn)行；噻唑膦的檢測(cè)按照《噻唑膦原藥》(HG/T 5421—2018)中方法進(jìn)行。

6%噻唑·膦氨基寡糖素水乳劑質(zhì)量技術(shù)指標(biāo)測(cè)試參照《農(nóng)藥水乳劑產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)范》(HG/T 2467.9—2003)執(zhí)行。

1.3.3 藥劑對(duì)南方根結(jié)線蟲2 齡幼蟲的離體毒力測(cè)定

2齡幼蟲(J2)的采集：從發(fā)病根系中取出的卵囊，消毒后放入含有少量無菌水的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃培養(yǎng)箱2 d，每隔24 h 后收集1 次新孵化的根結(jié)線蟲，將孵化出的2 齡幼蟲吸入三角瓶中，加入適量無菌水，置于4 ℃冰箱中備用。

處理方法：取無菌的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在超凈工作臺(tái)內(nèi)向每孔加入定量的南方根結(jié)線蟲2 齡幼蟲(J2)，并加入對(duì)應(yīng)的藥劑，無菌水補(bǔ)足至1 mL，并用封口膜封好24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的上下蓋，將培養(yǎng)板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。

結(jié)果調(diào)查：72 h 后在解剖鏡下計(jì)數(shù)各孔內(nèi)線蟲總數(shù)和死亡數(shù)，以線蟲僵直不動(dòng)視為死亡。以清水為對(duì)照，按如下公式計(jì)算死亡率和校正死亡率。

2 結(jié)果分析

2.1 溶劑的選擇

水乳劑主要以水為介質(zhì)，相較于乳油來說，是減少二甲苯、三甲苯、溶劑油等溶劑用量的首選途徑。噻唑膦在水中溶解性很低，但與芳烴類溶劑互溶，而氨基寡糖素與水互溶，不能溶于芳烴類溶劑中，因此可以選用芳烴類溶劑作為主要溶劑。同時(shí)油相和水相之間的密度差會(huì)影響水乳劑的穩(wěn)定性，密度差越大，液滴聚沉速率越快，越不利于水溶劑的穩(wěn)定性，反之，水相和油相則不易分層[1]。已知氨基寡糖素水相密度約為1.02 g/mL，選擇二甲苯、S-150 和S-200 作為溶劑，制備噻唑膦油相，測(cè)定其密度，篩選密度差最小的油相方案(表1)。

表1 溶劑及其用量篩選

由表1 可知：以S-200 為溶劑，用量25%時(shí)，油相密度與水相密度最接近。

2.2 乳化劑的選擇

水乳劑的關(guān)鍵配制技術(shù)在于乳化劑體系的篩選，通過預(yù)試驗(yàn)確定了該水乳劑體系所需的乳化劑HLB 值為13~18，選擇乳化劑EL360、600#、34#、SC、500LQ、Tween 80 制備水乳劑，觀察不同助劑對(duì)該體系穩(wěn)定性的影響，篩選最優(yōu)乳化劑(表2)。

表2 單一乳化劑的篩選

由表2 可知：乳化劑SC 制備的水乳劑入水油珠狀分散，入水分散性差，稀釋穩(wěn)定性不合格，出現(xiàn)了沉淀；乳化劑Tween 80 制備的水乳劑黏度偏大，黏壁現(xiàn)象嚴(yán)重，入水分散性差，乳液出現(xiàn)沉淀而不合格，乳化劑600#配制的水乳劑入水分散性差，有沉淀。使用EL360、34#、500LQ 制備的水乳劑雖然熱儲(chǔ)和低溫時(shí)有析水或析油現(xiàn)象，但不太嚴(yán)重，且稀釋穩(wěn)定性合格，需要進(jìn)一步的開展助劑間的復(fù)配以篩選合適助劑組合實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的穩(wěn)定性(表3)。

表3 乳化劑組合的篩選

由表3 可知：不同乳化劑組合制備的水乳劑稀釋穩(wěn)定性均合格，EL360+34#+500LQ 低溫和熱儲(chǔ)析油率相對(duì)最低，乳液穩(wěn)定性和水乳劑體系穩(wěn)定性最優(yōu)。而其他組合均有不同程度的析水或析油現(xiàn)象。因此，選擇EL360+34#+500LQ 作為乳化劑，用量為3%+2%+1%。

2.3 防凍劑的選擇

6%噻唑膦·氨基寡糖素水乳劑水含量超過50%，中國(guó)緯度跨越范圍大，南北溫差大，考慮到凍融后分層析油、析水導(dǎo)致產(chǎn)品不穩(wěn)定的問題，需要在配方中加入防凍劑，本文對(duì)乙二醇、丙二醇、丙三醇進(jìn)行篩選(表4)。

表4 防凍劑的篩選

由表4 可知：丙二醇和丙三醇用量為10%時(shí)，防凍效果均能滿足配方要求，從性價(jià)比方面考慮，選擇丙三醇作為該配方的防凍劑。

2.4 加工工藝的選擇

水乳劑的制備通常采用直接乳化法和轉(zhuǎn)相法，由表5 可知：轉(zhuǎn)相法比直乳法分散相細(xì)度更高，穩(wěn)定性更好。粒徑分布圖也說明轉(zhuǎn)相法制備的6%噻唑膦·氨基寡糖素水乳劑粒徑更小(圖1)，故采用此工藝進(jìn)行加工。

圖1 不同加工工藝制備的6%噻唑膦·氨基寡糖素EW 粒徑分布圖

表5 不同加工工藝制備的6%噻唑膦·氨基寡糖素水乳劑在不同儲(chǔ)存溫度時(shí)的平均粒徑 (μm)

2.5 穩(wěn)定劑的選擇

噻唑膦與氨基寡糖素復(fù)配易出現(xiàn)分解的問題，為了防止噻唑膦分解，在該配方中加入穩(wěn)定劑環(huán)氧大豆油，經(jīng)過熱儲(chǔ)試驗(yàn)測(cè)定，當(dāng)環(huán)氧大豆油的用量為2%時(shí)，可將噻唑膦的分解率控制在5%范圍內(nèi)(表6)。

表6 穩(wěn)定劑的篩選

2.6 優(yōu)選配方及其質(zhì)量控制指標(biāo)檢測(cè)

經(jīng)過上述篩選，確定6%噻唑膦·氨基寡糖素水乳劑的優(yōu)選配方：噻唑膦5%，氨基寡糖素1%，溶劑油S-200 25%，EL360 3%，34#2%，500LQ 1%，丙三醇10%，環(huán)氧大豆油2%，蒸餾水補(bǔ)足100%。該制劑產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)(表7)，且具有較好的產(chǎn)品穩(wěn)定性能。

表7 6%噻唑膦·氨基寡糖素水乳劑質(zhì)量控制指標(biāo)

2.7 6%噻唑膦·氨基寡糖素水乳劑對(duì)南方根結(jié)線蟲2 齡幼蟲的室內(nèi)毒力測(cè)定

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果(表8)表明：1%氨基寡糖素水劑對(duì)南方根結(jié)線蟲2 齡幼蟲基本無效；200 mg/L 6%氨基寡糖素·噻唑膦水乳劑處理南方根結(jié)線蟲2 齡幼蟲的校正死亡率為85%，明顯高于同等劑量噻唑膦單劑。表明6%噻唑膦·氨基寡糖素水乳劑對(duì)南方根結(jié)線蟲2 齡幼蟲具有良好的殺滅作用。

表8 6%噻唑膦·氨基寡糖素水乳劑對(duì)根結(jié)線蟲的室內(nèi)毒力測(cè)定

3 結(jié)論

通過對(duì)溶劑、乳化劑、防凍劑和穩(wěn)定劑的篩選及加工工藝的選擇，確定了6%噻唑膦·氨基寡糖素水乳劑的最佳配方和最優(yōu)生產(chǎn)工藝。該配方物化性質(zhì)穩(wěn)定，各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)室內(nèi)毒力測(cè)定，6%噻唑膦·氨基寡糖素水乳劑對(duì)南方根結(jié)線蟲2 齡幼蟲具有良好的防效，用量200 mg/L 死亡率達(dá)85%，明顯高于噻唑膦單劑。