UiO-66 對種菌唑裝載量的高效液相色譜分析

張奇珍，劉小芳，高圖強，石鑫，劉鵬飛

(中國農業大學植物保護學院，北京 100193)

種菌唑(ipconazole，IPC)為日本吳羽化學公司于20 世紀90 年代初開發的新型三唑類殺菌劑，CAS 登錄號為125225-28-7，CIPAC 編碼為798，化學名稱2-[(4-氯苯基)甲基]-5-(1-異丙基)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基甲基)環戊醇，化學式：C18H24ClN3O[1]，結構式見圖1。種菌唑通過抑制病原菌麥角甾醇的生物合成而致效，對水稻惡苗病、胡麻斑病和稻瘟病表現出較好的防治效果，具有殺菌譜廣、活性高，兼具內吸和保護活性，且對單子葉和雙子葉作物均安全等特點[2]。

圖1 種菌唑結構式

金屬有機骨架(metal organic frameworks，MOFs)是以金屬原子為連接點，有機配位體支撐構成的一維、二維或三維骨架結構。作為一種新型多孔晶體材料，因其具有高孔隙率、結構多樣等特點，可被作為納米粒子載體使用[3-6]。本研究前期從眾多MOFs材料中選擇已在農業領域中顯示出良好應用潛力的UiO-66[7]作為載體，將種菌唑進行包載，制備出IPC@UiO-66 納米載藥顆粒，對種菌唑具有優秀的靶向運輸和控緩作用(未發表)。

目前已有文獻報道了種菌唑原藥、微乳劑以及懸浮劑的高效液相色譜和液質聯用技術的檢測分析方法[8-10]。高效液相色譜簡單、快速、重復性好，為常量分析的主流檢測手段。液質聯用方法的檢出限通常優于高效液相色譜法，多用于殘留檢測分析。IPC@UiO-66 中有效成分的定量分析目前尚無公開報道。與原藥和常規制劑分析不同，納米載藥體系中有效成分的準確定量對方法的前處理過程要求較高，需要篩選合適的溶劑對有效成分進行充分提取。因此，本文建立了一種測定IPC@UiO-66 中種菌唑裝載量的高效液相色譜分析方法，具有省時、經濟、準確、重現性好的優勢，可滿足定量分析要求。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑和試劑

種菌唑標準品(純度94.4%，BEPURE，北京曼哈格生物科技公司)；甲醇(色譜純，美國FISHER公司)；IPC@UiO-66 納米載藥顆粒(中國農業大學制備)。

1.2 儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Quintix224-1CN-1 電子天平(德國SARTORIUS 公司)；針筒過濾器：孔徑0.45 μm 濾膜(天津市科億隆實驗設備有限公司)；KQ-250DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Arium comfortⅡ型超純水系統(德國SARTORIUS公司)。

1.3 高效液相色譜操作條件

紫外檢測器：DAD G1315A；色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相：甲醇∶純水=80∶20(體積比)，流速：1 mL/min；進樣體積：5.0 μL；柱溫：室溫(溫度變化應不大于2 ℃)。

1.4 樣品前處理

對IPC@UiO-66 進行不同提取溶劑(甲醇、乙腈、純水)和不同超聲時間(5、10、20、30、50、70 min)的提取處理，篩選種菌唑的最佳提取條件。

1.5 測定步驟

1.5.1 標樣溶液的配制

稱取種菌唑標準品(50±0.5)mg，置于50mL的棕色容量瓶中，用甲醇超聲溶解，定容至50 mL。將上述標準溶液分別稀釋至0.005、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L 系列質量濃度，上機檢測用于工作曲線的建立。配制用于樣品定量計算的標準樣品溶液，稱取種菌唑標準品(12±0.5)mg，置于10 mL的棕色容量瓶中，準確移取2.0 mL上述溶液于10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容。

1.5.2 試樣溶液的配制

準確稱取IPC@UiO-66試樣(40±0.5)mg于25 mL的棕色容量瓶中，加入適量甲醇超聲波振蕩處理，冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜后待測。

1.5.3 測定

按1.3 節儀器參數及條件運行液相色譜，待儀器基線穩定后，連續注入數針標樣溶液，直至相鄰2 針的峰面積變化小于1.5%后，以標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進樣分析。

1.5.4 裝載量計算

將測得的2 針相鄰試樣溶液及前后2 針標樣溶液中的種菌唑峰面積分別進行平均，其中種菌唑有由異構體I (1RS, 2SR, 5RS)和異構體II (1RS, 2SR,5SR)組成[9-11]，計算峰面積時將異構體I 和異構體II 的峰面積相加，根據下式計算。

IPC@UiO-66 中種菌唑的裝載量X(%)：

式中：X為試樣中種菌唑的裝載量(%)；A1為標樣溶液中種菌唑峰(異構體I+異構體II)面積的平均值；A2為試樣溶液中種菌唑峰(異構體I+異構體II)面積的平均值；m1、m2分別為稱取的種菌唑標樣和試樣的質量(mg)；P為種菌唑標準品的純度(%)；k為種菌唑標樣和試樣的配制體積比值。

1.6 方法學考查

1.6.1 工作曲線建立

HPLC 檢測質量濃度為0.005、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L 的種菌唑系列標準溶液，待儀器基線穩定后，在優化的色譜分離條件下按低質量濃度到高質量濃度的順序測定種菌唑系列標準溶液峰面積，根據標樣濃度及其對應峰面積建立標準曲線，進行線性回歸，得到方程。

1.6.2 添加回收率測定

平行稱取15 份(40±0.5)mg不含種菌唑的空白金屬骨架UiO-66 試樣(同批次)于1.5 mL 離心管中，分別添加0.1 mL 質量濃度為20、40、80 g/L的種菌唑標準溶液，每個質量濃度水平重復5 次，混勻并靜置2 h 后，全部轉移至25 mL 棕色容量瓶中，按照1.3、1.4 節中甲醇超聲提取方法和色譜檢測條件進行提取和檢測，計算平均回收率以及相對標準偏差。

1.7 樣品檢測

平行稱取10 份(40±0.5)mg的IPC@UiO-66 試樣(同批次)于25 mL 棕色容量瓶中，按照1.3 節和1.4 節中甲醇超聲提取方法和色譜檢測條件進行提取和檢測，根據1.5.4 節中的公式，計算IPC@UiO-66 中的種菌唑裝載量。

2 結果與討論

2.1 檢測器波長的篩選

在1.3 節色譜條件下，種菌唑2 個異構體的保留時間約為9.7、10.7 min。使用高效液相色譜儀檢測器檢測種菌唑在210~400 nm 吸收波長范圍內的紫外吸收峰，得到種菌唑的紫外吸收光譜圖，發現種菌唑在222 nm 波長處有最大紫外吸收峰(圖2a)，在該波長下，儀器響應較好，試樣色譜圖中未顯示其他雜質峰(圖2b)，因此選擇222 nm 作為種菌唑的檢測波長。

圖2 種菌唑的紫外吸收譜圖(a)及試樣(b)高效液相色譜圖

2.2 方法的線性相關性

以種菌唑的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標建立標準曲線，擬合得到線性方程y=9 903x-32.914，相關系數R2=0.999 9。說明在質量濃度為0.005~0.5 g/L 內，種菌唑的質量濃度與峰面積線性關系良好(圖3)。

圖3 種菌唑峰面積與質量濃度關系圖

2.3 提取溶劑和超聲時間的篩選

對IPC@UiO-66 進行不同介質(甲醇、乙腈、純水)和不同超聲時間(5、10、20、30、50、70 min)的處理，結果見圖4。可見，超聲處理后，IPC@UiO-66 在甲醇和乙腈有機相中能較好分散，但在純水中聚集成塊，最終導致無法將種菌唑充分提取。甲醇超聲30 min 種菌唑的裝載量相較于超聲50、70 min 幾乎沒有差異。用乙腈作為提取介質，在70 min 內不能充分提取有效成分，提取效率僅為理論裝載量的72.21%。因此本研究最終選擇甲醇為提取介質，超聲時間為30 min。

圖4 溶劑與提取時間對UiO-66 提取效率的影響

2.4 方法準確度

在不含種菌唑的空白金屬骨架UiO-66 試樣中添加3 種不同質量濃度水平的種菌唑標準溶液，混勻并靜置2 h 后用甲醇定容，超聲時間為30 min，在上述色譜條件下進行分析測定，結果見表1。實測值是IPC@UiO-66 中種菌唑的檢出量，理論添加量和實際檢出量與農藥殘留分析的固定添加水平表述方式不同，主要原因在于添加的種菌唑的質量相比于載體質量不能忽略。通過計算，得到UiO-66中種菌唑的加標回收率為98.71%~99.34%，相對標準偏差為0.62%~1.62%，說明該方法對IPC@UiO-66中種菌唑具有良好的提取率，滿足檢測要求。

表1 UiO-66 中種菌唑添加回收率

2.5 樣品檢測

在同一批次IPC@UiO-66 樣品中平行稱取10 個試樣，進行色譜分析，分別計算其種菌唑裝載量，結果見表2，含量分布范圍為14.47%~14.61%。

表2 IPC@UiO-66 樣品中種菌唑裝載量檢測

3 結論

本研究采用高效液相色譜儀建立了一種檢測IPC@UiO-66 中有效成分種菌唑的方法。該方法準確、重現性好，且操作簡便，可以應用于含有種菌唑的UiO-66 金屬骨架中有效成分包封率和裝載量的分析，同時也為UiO-66 裝載其他種類農藥的檢測提供了技術參考。