不同周期的高脂血癥大鼠模型的相關指標變化分析*

侯紅平 張廣平 彭 博 魏曉露 王麗芳 宋 玲 高云航 陳騰飛 寧良菊

(1.中國中醫科學院中藥研究所,北京 100700)(2.四川大學華西醫院干細胞與組織工程研究室,成都 610041)

高脂血癥是一種常見的血脂代謝異常的疾病,血脂異常通常與三酰甘油(triglyceride,TG)和膽固醇(cholesterol,CHO)增高密切相關。二者雖然可以通過生化檢測等方法快速便捷地得到,但是血脂異常對身體的損害往往不容易被發現,且存在一定程度的忽視[1]。由于血脂異常的損傷持續存在,對身體各種組織和細胞持續造成威脅,隨著血脂水平的不斷升高,其損傷程度也會不斷加重,造成機體代謝紊亂[2],進而產生動脈粥樣硬化[3]、腎功能不全[4]、高血壓[5]等一系列嚴重危害人類健康的并發癥。因此,積極地預防和治療高脂血癥的發生和發展是一項艱巨的任務。

目前,高脂血癥動物模型的制作方法有很多種,但最常用的還是高脂飼料喂養大鼠來制備。大鼠遺傳背景明確、價格低廉、方便飼養、血液和組織容易獲得,在脂質代謝的研究中是一種應用較為廣泛的實驗動物。但是,在制作模型的過程中,我們發現,大鼠高脂血癥的周期不明確,有的為4周,有的為6周,有的為8周,同時模型制備過程中血脂水平的表達變化有待商榷[6-8]。為此,本研究通過高脂飼料喂養大鼠,通過設置不同實驗周期,檢測各組動物的血脂水平和氧化應激水平,科學地分析和探討不同周期高血脂癥大鼠的血脂變化及其規律,為后續研究提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:SD大鼠,雄性,60只,5～6周齡,體質量150～170 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,生產許可證號【SCXK(京)2016-0011】。飼養于中國中醫科學院中藥研究所實驗動物屏障環境(SPF級)中,使用許可證號【SYXK(京)2019-0003】。所有實驗操作均按照中藥研究所動物倫理委員會的批準,倫理審批號:2021B125-1。

1.1.2主要試劑和儀器:高速冷凍離心機(Sigma公司,型號:3-18KS);全自動生化分析儀(佳能集團,型號:TBA-120FR)。

甘油三酯試劑盒,膽固醇試劑盒,高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL),低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL),天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST),丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT),丙二醛(malondialdehyde, MDA),均購于北京索萊寶科技有限公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒,總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)檢測試劑盒,均購于碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1實驗分組:所有動物在檢疫1 d,適應5 d后,按體質量隨機分為對照組和處理組,兩組別再分為0,15,30,60 和90 d 5個小組,每組6只。對照組正常攝食飲水,處理組正常飲水,但給予高脂飼料(基礎飼料+15%豬油+20%蔗糖+1.2%膽固醇+0.2%膽酸鈉)喂養,每天觀察余料,不夠時及時補充飼料,連續喂養90 d。實驗期間,每周稱一次動物體質量,同時觀察動物的飲食情況、外觀、活動狀況等。

1.2.2處理動物及檢測指標:在0,15,30,60和90 d不同時間節點分別處理動物。處理前動物禁食約16 h后,48 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,腹主動脈采血,肝稱重,部分肝組織置于4%多聚甲醛中,進行HE病理染色觀察。血清3 000 r/min 離心15 min后,采用全自動生化儀檢測血脂水平和肝代謝指標。部分肺組織勻漿后,3 000 r/min 離心15 min取上清,BCA檢測蛋白濃度,采用全自動生化儀檢測血脂水平和肝代謝指標。同時利用試劑盒檢測血清中的氧化應激指標,具體操作詳見說明書。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 不同周期大鼠的一般狀態觀察

對照組不同時間節點的動物均能自主活動,精神狀態良好,毛色有光澤,二便正常。處理組大鼠造模開始初期,體質量增長明顯,但15 d后,出現飲食減少,體質量增長有所降低的趨勢,分析認為與高脂飼料飲食密切相關。但30 d后,上述情況有所緩解,排便量增加,被毛暗淡無光澤,出現脫毛、行動遲緩的狀態,上述情況一直持續到90 d。

2.2 不同周期大鼠的體質量及肝系數

對照組不同時間節點的動物體質量持續增加,肝系數基本在2 g/100 g左右。而處理組動物體質量自15 d增長較為明顯,直到90 d體質量與同時期的對照組相比,差異具有統計學意義(P<0.05)。處理組動物的肝系數自30 d開始明顯增加,與對照組相比,差異具有統計學意義(P<0.05)。提示處理組的肝組織自30 d出現水腫等病變(表1)。

表1 不同周期大鼠體質量及肝系數Table 1 Body mass and liver coefficient of rats

2.3 不同周期大鼠血清中血脂相關指標和生化指標的表達

與同周期的對照組相比,處理組30 和60 d TG明顯的升高,差異具有統計學意義(P<0.05),但90 d的TG 與對照組相比,差異并無統計學意義;處理組30 和60 d CHO明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.05),90 d的CHO有所降低,但與對照組相比,差異具有統計學意義(P<0.05);處理組15、30、60和90 d的LDL較對照組有所升高,差異具有統計學意義(P<0.05);處理組60 和90 d的HDL、AST和ALT較對照組有所升高,差異具有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 不同周期大鼠血清中血脂相關指標和生化指標的表達Table 2 Expression of blood lipid-related indexes and biochemical indexes in serum of rats in different cycles

2.4 不同周期大鼠組織中血脂相關指標和生化指標的表達

與對照組相比,處理組的TG、LDL在15 d即明顯升高,CHO、HDL、AST和ALT在30 d明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.05)(表3)。

表3 不同周期大鼠組織中血脂相關指標和生化指標Table 3 Blood lipid-related indexes and biochemical indexes in rat tissues of different

2.5 不同周期大鼠血清中氧化應激指標

對照組不同周期大鼠的血清中MDA含量逐漸升高,SOD和T-AOC有所降低,但并未達到統計學差異,分析認為與動物衰老的氧化損傷逐漸增強相關。而處理組動物,自15 d開始MDA處理升高,SOD明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。T-AOC自30 d開始明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05)(表4)。

表4 不同周期大鼠血清中氧化應激指標的表達Table 4 Expression of oxidative stress indexes in serum of rats in different

2.6 肝病理學觀察

HE組織病理染色顯示,對照組動物的肝組織自0 到90 d結果正常,肝竇清晰可見,細胞形態飽滿正常,細胞核和細胞質均正常。而處理組動物的肝組織自15 d開始,淋巴細胞聚集,肝細胞腫脹變性,細胞核擠向一側,直到90 d肝索排列紊亂,肝細胞腫脹,發生脂肪變性,胞質內有大小不等的空泡肝血竇受壓變形等病理改變(圖1)。

注:A. 對照組(0 d),B. 對照組(90 d),C. 處理組(15 d),D. 處理組(30 d),E. 處理組(60 d),F. 處理組(90 d)。Note:A.Control group (0 d), B.Control group (90 d), C.treatment group (15 d), D.treatment group (30 d), E.treatment group (60 d),F.treatment group (90 d).

3 討論

混合型高脂飼料喂養是最常見的高脂血癥模型,操作較為方便,成模率也較高。本研究中混合高脂飼料除了常規的基礎飼料外,含有15%豬油、20%蔗糖、1.2%膽固醇和0.2%膽酸鈉。豬油主要含有飽和高級脂肪酸甘油酯,能夠影響甘油三酯的水平,補充體內脂肪,促進TG和TC的生成[9]。蔗糖在體內能夠轉化后,以糖原或脂肪的形式貯存在體內,能夠促進體內各種血脂成分的生成。膽固醇主要影響血清中T-CHO和LDL的水平。膽酸鈉能夠促進大戶對膽固醇和脂肪的吸收,造成脂代謝紊亂,迫使動物迅速形成高脂血癥。在動物血清中,TC的水平主要受膽固醇的影響,TG水平則有豬油的比例密切相關[10]。在我們的高脂血癥模型中,高脂飼料喂養30 d后,大鼠血清中的TG、TC和LDL出現不同程度的升高,提示造模的成功。

但造模90 d后,血清中TC和TG卻出現明顯的下降,TG與對照組相比,差異不具有統計學意義(P>0.05)。但經肝組織勻漿后檢測血脂水平發現,肝組織中的TC和TG升高較為明顯,且與對照組相比,差異具有學意義(P<0.05)。有文獻報道[11],也提出了血清中TG低于對照組的情況。高脂飼料喂養的大鼠血脂水平在體內呈現“升高-適應-升高”的模式。有研究[12]發現,添加膽固醇喂養的大鼠體內,膽固醇合成的關鍵酶羥甲基戊二酸單酰輔酶A 還 原 酶的活性下降,同時增加膽固醇值的合成,促使膽固醇值優先向極低密度脂蛋白內填充,導致肝外轉移的TG減少,造成血液中TG降低、肝中TG蓄積。這也間接證明了高脂血癥模型脂質代謝的紊亂和復雜性。基于上次發現和深層次的原因,建議高脂血癥動物模型在30 d后,除了血清中血脂水平的檢測,同時增加肝組織中血脂水平,肝代謝水平以及氧化應激指標等多方面的檢測指標,以便更科學、全面的說明問題。

高脂血癥模型是個周期較長的代謝性疾病。在我們的前期研究中,同時比較了雌鼠在喂養高脂飼養后的血脂水平變化,發現與雄性相差甚大,故未展現在本研究中。專門比較雄雌大鼠喂養高脂飼料后血脂的代謝變化,發現雄性大鼠表現為體質量增加合并典型的高膽固醇血癥(II a 型),而雌性大鼠主要表現為體質量減低合并混合型高脂血癥(II b 型)[13]。因此,在今后的研究與分析中,應注重雄性和雌性動物在此方面的差異。

綜上,高脂血癥動物模型成模率較高,但在藥物預防和治療作用的研究與分析中,應考慮到代謝的變化和周期的長短,除了血清指標外,建議增加組織和其他代謝酶活性的檢測指標,更科學地分析藥物的作用。