通腑理肺湯對膿毒癥腸屏障損傷大鼠腸黏膜組織閉鎖小帶蛋白-1、閉合蛋白 mRNA及蛋白表達的影響

柳 蔓,呂 波,李 蘭,陳 立

(1.貴州中醫藥大學第二附屬醫院兒科,貴州 貴陽 550001;2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院重癥醫學科,貴州 貴陽 550001;3.廣東省中醫院急診科,廣東 廣州 510120)

膿毒癥主要由各種病原微生物等侵入機體后引發的感染反應失調,最終導致的一系列器官功能衰竭的一種綜合征,其致死率呈逐年上升趨勢。隨著病情進展,會造成膿毒癥休克,引起多器官功能綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[1]而危及生命。腸道屏障指腸道上皮具有分隔腸腔內物質,防止致病性抗原,如細菌和內毒素向腸腔外組織、器官和血循環移位的結構和功能的總和。膿毒癥腸屏障損傷的病理基礎在于,膿毒癥可引起腸屏障功能紊亂甚至腸衰竭,腸屏障功能損害還可促使腸道內菌群移位[2-3],使膿毒癥反應再次加重,因此,膿毒癥腸屏障損傷的互為影響,對于如何保護腸道功能、減少菌群移位引起的腸損傷,成為當今膿毒癥腸屏障損傷的重要內容。研究顯示,腸道黏膜的主要細胞質跨膜蛋白和調節蛋白閉合蛋白(Occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)表達的高低與腸黏膜通透性成反比關系,當Occludin、ZO-1蛋白表達降低時,腸道黏膜通透性明顯增強,進而造成腸屏障的破壞。中醫藥干預膿毒癥腸黏膜屏障損傷近幾年受到關注,但治療多偏向在單純應用通腑法改善腸屏障功能,效果不確切[4]?，F代研究已經證實,膿毒癥腸屏障損傷同時伴有肺功能損傷[5],基于“肺與大腸相表里”理論為指導,應用“肺腸合治”治療原則,創立的通腑理肺湯(TFL),臨床上廣泛用于膿毒癥胃腸功能衰竭危重患者的救治,收到了確切的臨床效果[6],但對膿毒癥腸黏膜屏障干預的具體機制不清。本研究通過采用育腸結扎穿孔(CLP)法建立實驗動物模型的基礎上,應用TFL干預,檢測大鼠腸黏膜組織緊密連接蛋白ZO-1、Occludin mRNA基因及蛋白表達,同時在光鏡及透射電鏡下行腸黏膜組織病理觀察,進一步探討TFL在膿毒癥發生時,對腸黏膜屏障造成損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SD大鼠購自于SLAC ANIMAL公司[動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0015],由貴州中醫藥大學實驗動物中心提供。按隨機數字表法分為假手術組、模型組、TFL低劑量組、TFL高劑量組,每組各10只。

1.1.2 實驗試劑：Occludin抗體(貨號：ab216327,美國Abcam公司);ZO-1抗體(貨號：#2847,美國CST公司);SYBR GreenqPCR試劑盒(貨號：RR820A,日本Takara Biotechnology公司)、逆轉錄試劑盒(貨號：A3500,日本Takara Biotechnology公司);BCA蛋白定量試劑(貨號：pc0020,北京索萊寶科技);蛋白酶抑制劑(貨號：60237,江蘇康為世紀);Western Blotting Luminol Reagent(貨號：sc-2048,Santa Cruz Biotechnolog公司)。

1.1.3 實驗儀器：實時熒光定量PCR儀(型號：Light CyclerH 480,羅氏公司);VE186轉膜儀(型號：VE186,天能公司);CMax Plus酶標儀(型號：CMax Plus,MD);病理切片機(型號：RM2016,上海Leika生物系統);脫水機(型號：JJ-12J,武漢俊杰);包埋機(型號：JB-P5,武漢俊杰電子有限公司);透射電子顯微鏡(型號：JEM-1230,日本HITACH公司)。

1.2 實驗方法 應用CLP[7]法制作膿毒癥腸屏障損傷大鼠模型;假手術組只暴露盲腸,不做穿孔處理。TFL低劑量組造模成功后給予3.6 g/kg體重TFL灌胃;TFL高劑量組造模成功后,按7.2 g/kg體重TFL灌胃干預;模型組、假手術組相同條件下,均按照蒸餾水10 ml/kg體重灌胃干預,以上每組均每天干預1次,實驗周期為7 d。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.3 實驗指標檢測

1.3.1 腸黏膜組織ZO-1、Occludin mRNA的測定：采用RT-qPCR法檢測腸黏膜組織 ZO-1、Occludin mRNA：根據說明書,使用RNA提取試劑盒從SD大鼠腸黏膜組織中收集總RNA。用NanoDrop分光光度計對提取的RNA進行定量。使用特定的引物在50 ℃下逆轉錄45 min。SYBR Premix Ex Taq與Applied Bio-Rad CFX96序列檢測系用于PCR程序。根據以下條件進行PCR：95 ℃ 5 min,然后在95 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s和72 ℃ 30 s進行40個循環,最后在72 ℃進行延伸步驟5 min。ZO-1、Occludin的表達水平通過閾值循環Ct確定,相對表達水平通過2-Cq方法計算。RT-qPCR所用引物序列信息見表1。

表1 引物序列

1.3.2 腸黏膜組織ZO-1、Occludin 蛋白的測定：通過蛋白質印跡法(Western blot)檢測腸黏膜組織 ZO-1和Occludin蛋白的水平。應用蛋白提取試劑盒從腸組織中分離總蛋白,BCA試劑盒進行定量。在12%的SDS-Polycramide凝膠上分離出約40 μg蛋白質,將凝膠轉移到PVDF膜上,5%TBST脫脂奶粉封閉薄膜60 min,參考試劑盒說明書,按照適當比例封閉液稀釋一抗,再次將膜轉移至一抗中,4 ℃搖床緩慢搖動孵育過夜?；厥找豢?再次加入TBST洗滌液,洗滌5～10 min,共3次。稀釋抗兔IgG辣根過氧化酶偶聯抗體二抗,常溫下,搖動孵育120 min,再次回收二抗,加入TBST洗滌液,洗滌10 min,共3次。最后將X線膠片暗示中感光、顯影、定影,將印跡與ECL試劑一起孵育并暴露于Tanon5200-multi以檢測ZO-1和Occludin蛋白質表達。

1.3.3 腸黏膜組織光鏡下病理觀察：7 d后,用苯巴比妥鈉200 mg/kg腹腔注射將SD大鼠安樂死后觀察。收集每只動物的腸黏膜組織并用無菌水沖洗。用70%、80%、90%的乙醇溶液依次將組織脫水,并摻入等量的乙醇、二甲苯。在室溫下孵育15 min后,將組織與等量的二甲苯在室溫下混合15 min。重復該步驟直至黏膜組織看起來透明。然后用石蠟包埋黏膜組織,切片(4 μm),在光學顯微鏡下用HE在室溫下染色30 min,對腸黏膜組織病理變化進行拍照、觀察。

1.3.4 腸黏膜組織透射電鏡下超微結構觀察：7 d后對SD大鼠用上述相同方法處死,將腸黏膜組織收集起來,用2.5%的戊二醛固定2 h,用0.1 mol/L的磷酸溶液清洗3次。然后用1%的酸液將組織固定2～3 h,再用0.1 mol/L的磷酸液清洗3遍。依次用乙醇(50%、70%、90%、90%)和90%丙酮(V∶V=1∶1)、90%丙酮沖洗組織15～20 min。隨后,將腸黏膜組織與100%丙酮在室溫下孵育3次,每次15～20 min。用丙酮(100%)和包埋液與組織一起孵育3～4 h。最后,將腸黏膜組織和包埋液在37 ℃的烘箱內依次孵化過夜,在45 ℃的烘箱內孵化12 h,在60 ℃的烘箱內孵化48 h。將腸黏膜組織切成冠狀切片(30 μm),載玻片用3%醋酸鈾和3%檸檬酸鉛染色15 min。在透射電子顯微鏡下觀察和拍攝腸黏膜組織的超微結構變化。

2 結 果

2.1 腸組織中ZO-1、Occludin mRNA表達比較 模型組大鼠腸黏膜組織中ZO-1、Occludin mRNA基因表達對比假手術組均顯著降低(P<0.05)。TFL各劑量組大鼠腸黏膜組織中ZO-1、Occludin mRNA基因表達對比模型組均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 腸組織中ZO-1、Occludin mRNA表達水平

2.2 腸組織中ZO-1、Occludin 蛋白水平比較 模型組大鼠腸黏膜組織中ZO-1、Occludin蛋白表達對比假手術組均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。TFL各劑量組大鼠腸黏膜組織中ZO-1、Occludin蛋白表達對比模型組均顯著升高(P<0.05,P<0.01) (圖1)。

圖1 腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達水平

2.3 腸黏膜組織光學顯微鏡下觀察 見圖2。假手術組：腸組織結構及黏膜絨毛無萎縮、無變形、無破壞,排列正常,未見淋巴及中性粒細胞聚集,黏膜組織見血管無損傷;模型組：腸組織結構及黏膜絨毛嚴重受損,絨毛排列不規則,明顯變形,腸黏膜上皮明顯腫脹,同時可見固有層明顯分離,伴基底層破裂壞死,黏膜組織間可見大量淋巴細胞、中性粒細胞等浸潤;TFL低劑量組及高劑量組：腸黏膜上皮組織及絨毛中度受損,黏膜上皮輕度水腫,輕微出血,固有層無分離,輕微腫脹,絨毛結構基本完整,無明顯出血壞死,可見少許的淋巴細胞及中性粒細胞聚集。

圖2 各組腸黏膜組織病理形態(HE染色,×400)

2.4 腸黏膜組織透射電鏡超微結構觀察 見圖3。假手術組：微絨毛無變形,橋粒完整,絨毛細胞無水腫,線粒體清晰;模型組：微絨毛減少變形,橋粒不完整絨毛細胞水腫更明顯,線粒體水腫和空泡改變,腸上皮細胞間隙明顯變寬,腸細胞間連接復合體變短變寬;TFL低劑量組及高劑量組：微絨毛密集且規則,腸細胞間呈鋸齒狀和互鎖模式,線粒體清晰。

圖3 各組腸黏膜組織透射電鏡超微結構(醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,×16000)

3 討 論

腸黏膜屏障是指分隔腸腔內物質,防止致病性抗原,如細菌和內毒素向腸腔外組織、重要臟器和血循環移位的結構和功能的總和[8],具有抵御外來有害物質對機體的侵襲作用[9]。腸道黏膜屏障可分為四個部分：機械、化學、免疫和生物屏障[10-11],其中發揮最關鍵作用的是腸道上皮細胞構成的機械屏障,腸道上皮細胞之間主要通過Occludin和ZO-1將蛋白質緊密地連接在一起,形成一個完整的生物屏障。Occludin是緊密連接結構中的一種重要結構跨膜蛋白,對于維持細胞間緊密聯系以及腸道通透性發揮重要作用。ZO-1蛋白主要分布在細胞質內膜表面,屬于胞質蛋白,與骨架結構以及細胞間連接結構的其他蛋白,主要是介導緊密連接的開合作用,起著細胞間緊密連接的樞紐作用。因此,Occludin和ZO-1緊密連接蛋白在腸屏障功能的調節方面有重要的作用。

膿毒癥是機體對炎癥反應導致的器官功能損傷為主要表現的一種臨床綜合征,以臟腑功能紊亂和臟器損害為主要表現,病死率逐年升高[12-13]。隨著病情進展,可出現肺、肝腎、循環、胃腸道等多個臟器引起MODS[14]。在膿毒癥的發生機制中,腸道作為人體最大的細菌和內毒素的貯藏部位,是膿毒癥最早侵犯且影響最嚴重的器官之一,起著重要的作用[15]。研究證實,膿毒癥腸道的通透性的增加和菌群移位與腸黏膜組織中ZO-1、Occludin蛋白降低密切相關[16-17]。在多種炎癥和病理狀態環境中,腸道黏膜緊密連接蛋白在受到炎癥介質[18]的刺激下,會導致其黏膜完整性受到損壞,進而出現通透性增強,腸黏膜屏障功能受損[19-20],導致菌群移位,血漿內毒素增加等,最終表現為腸道黏膜組織學及超微結構異常。腸黏膜屏障的破壞,一方面可使經細胞途徑的腸腔內抗原和細菌通過增加;另一方面使流經門脈系統和腸系膜淋巴系統的大量細菌、內毒素、抗體等炎性介質增加,最終引起活化炎癥級聯反應,激活獲得性免疫系統,引起免疫反應和組織損傷[21],加重腸屏障功能障礙。因此,腸黏膜屏障功能對膿毒癥的發展及預后起著關鍵作用[22]。本研究顯示通過CLP建立的膿毒癥腸屏障損傷動物模型,在膿毒癥發生時,腸黏膜組織中Occludin、ZO-1 mRNA基因水平及蛋白表達均顯著下調,提示腸黏膜緊密連接在炎性刺激下緊密連接蛋白被破壞,導致腸壁通透性增高,黏膜屏障受損,這與過去的實驗研究結果相符合[23]。

通腑理肺湯是基于“肺與大腸相表里”理論基礎,在國醫大師劉尚義學術思想指導下創立,全方由大黃、芒硝、連翹、黃芩、杏仁、厚樸、白及和三七組成,具有通腑泄濁、清熱宣肺、化瘀解毒的功效。針對膿毒癥腸屏障損傷“邪毒壅盛、熱結腸腑”的病理特點,采用“肺腸合治”[24]的治法,在前期及既往的臨床試驗中顯示對膿毒癥胃腸功能障礙患者有良好的保護作用[6,25],但是通腑理肺湯對于腸屏障功能的改善作用尚不清楚。故本實驗建立膿毒癥腸黏膜損傷大鼠模型,從基因、蛋白水平以及腸道黏膜病理組織學、超微結構方面,對通腑理肺湯干預膿毒癥腸黏膜屏障進行實驗研究。實驗研究發現,膿毒癥發生時Occludin、ZO-1 mRNA基因水平及蛋白表達量均降低,模型組尤為明顯,提示緊密連接蛋白受損,腸黏膜屏障破壞。給予通腑理肺湯治療后,治療組大鼠腸組織中ZO-1、Occludin mRNA基因水平及蛋白表達水平顯著上升,提示該組方對于ZO-1、Occludin兩種蛋白的修復具有很好的效果;同時腸黏膜光鏡下病理組織學顯示,治療組腸黏膜上皮細胞水腫、腸黏膜絨毛受損、淋巴細胞及中性粒細胞浸潤明顯減輕;電鏡下超微結構顯示腸細胞間呈鋸齒狀和互鎖模式,線粒體清晰,緊密連接輕微受損。因此,本實驗研究發現,通腑理肺湯能夠減輕膿毒癥造成的腸屏障病理損害,改善腸屏障功能,可能是通過調節緊密連接蛋白的表達,改善腸組織緊密連接作用實現。