解毒活血湯對慢性腎臟病大鼠腎臟FGF23、Klotho表達的影響

周 鵬,孫妲男,李 勇,徐 麗,喬 偉

(1.黑龍江中醫藥大學研究生院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院腎內科,黑龍江 哈爾濱 150001)

慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)發病率近年來逐年升高,有研究結果證明,其在全球一般人群中的患病率已經高達14.3%[1]。鈣磷代謝紊亂是CKD患者常見的臨床表現,它會導致礦物質和骨代謝的異常,引發腎性骨病、多系統功能損傷、心血管意外事件高發等[2]。目前臨床治療CKD鈣磷代謝紊亂采用的主要治療方法為調節血磷與血鈣,治療繼發性甲狀旁腺功能亢進癥[3]。成纖維細胞生長因子23(Fibroblast growth factor,FGF23)是由來自于長骨中的成骨細胞與骨細胞合成和分泌的,其可作用于腎臟,參與調節機體血磷,使其維持動態平衡[4]。Klotho具有預防血管鈣化(Vascular calcification,VC)的作用,能夠抑制磷的吸收,加速尿磷的排泄進而減輕機體磷負荷[5]。本研究基于《內經》“去菀陳莝”理論及慢性腎衰“脾腎虧虛、濕濁瘀血阻脈”病機,有其理論依據;臨床實踐也證實解毒活血湯對CKD患者臨床療效較好,可顯著改善腎功能和鈣磷平衡[6],但關于解毒活血湯是如何影響CKD所致鈣磷代謝紊亂的研究仍較少。綜上,本次實驗探討解毒活血湯對慢性腎臟病大鼠腎功與腎臟FGF23、Klotho蛋白表達的影響以及其對Ca、P的影響,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 NW10LVF型超純水系統購于香港Heal Force公司;DW HL-668型-70 ℃超低溫冰箱購于安徽中科美菱公司;UV752N型紫外可見分光光度計購于上海佑科公司;Synergy H1型多功能酶標儀購于美國 BioTek公司;HH-4型數顯恒溫水浴鍋購于金壇榮華儀器公司;DYY-7C型電泳儀、DYCZ-24DN型雙垂直蛋白電泳儀購于北京六一公司;DH36001B型電熱恒溫培養箱購于天津泰斯特公司;H-2050R型超速冷凍離心機購于湖南湘儀公司;ELX-800型酶標儀購于美國 BIOTEK公司;磷測試盒(C006)、肌酐(Cr)測定試劑盒(C011)、鈣測試盒(C004)購于南京建成公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒(WLA004)、尿素氮(BUN)測試盒(WLA120)、全蛋白提取試劑盒(WLA019)、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒(WLA013)、Western洗滌液(WLA025)SDS-PAGE電泳液(干粉)(WLA026)、ECL發光液(WLA003)購于萬類生物公司;FGF-23 antibody(DF3596)、Klotho antibody(DF10309)購于中國 affinity公司。

1.2 實驗動物與模型制作 無特定病原體級(SPF)級健康雄性SD大鼠60只,6～8周齡,體重(210±10)g,購于黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心[實驗動物生產許可證號：SCXK(黑)2018-003],飼養于黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心[許可證號：SYXK(黑)2016004]。所有大鼠均飼養于無特定病原體級的動物房,光亮12 h光,12 h暗交替,溫度(23±3)℃,濕度45%～55%,自由飲食,飲水。隨機分為空白組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組,每組各12只。實驗均按照國際實驗動物使用和關懷指南對大鼠的進行處置。

造模方法：空白組不予處理,其余各組第1周至第4周,腺嘌呤250 mg/kg劑量每日灌胃1次,持續4周;第5周至第8周,同樣劑量的腺嘌呤隔日灌胃1次;第1周至第8周,模型鼠全部采用高磷飲食,含磷量為1.2%。第5周至第8周,中藥組用解毒活血湯灌胃治療,大鼠中藥給藥劑量按照人-大鼠體表面積換算(1∶6.25),并以臨床成人用藥劑量的1、2、4倍給藥,分為中藥低[1.4 g/(kg·d)]、中[2.8 g/(kg·d)]、高[5.6 g/(kg·d)]劑量組。空白組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液,連續給藥8周。每7 d記錄1次大鼠體重,服藥量按體重的變化調整,每天上午定時灌胃給藥。

1.3 實驗藥物 解毒活血湯：丹參、葛根各20 g,紅花、連翹、當歸、桃仁、枳殼、生地、柴胡、赤芍、甘草各15 g。中藥飲片均購于黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院飲片藥局,草藥用10倍蒸餾水浸泡0.5 h后,加蒸餾水煎煮2次,合并2次濾液,過濾濃縮至生藥含量2.8 g/ml,濃縮置于4 ℃冰箱備用。

1.4 標本采集方法 血液指標測定各組動物眼眶取血分離血清,大鼠處死前一天測體重并禁食,眼眶取血1 ml,離心留取血清,-20 ℃凍存(測定血清肌酐、尿素氮、鈣、磷)。

1.5 理化指標測定 各組大鼠分別于4、6、8周末取血,采用全自動生化分析儀檢測血鈣、磷、尿素氮、肌酐血液標本,按試劑盒說明操作。

1.6 Western blot檢測大鼠腎臟FGF23、Klotho蛋白表達 取大鼠腎臟加入裂解液,制成組織勻漿,4 ℃低溫條件下進行12000 r/min離心10 min,取上清定量蛋白。每組取40 μg蛋白,與上樣緩沖液混勻并沸水浴5 min,進行SDS凝膠電泳。結束后取凝膠,進行PVDF轉膜,4 ℃條件下浸于5%脫脂奶粉搖床緩慢搖動1 h,4 ℃條件下一抗溶液(FGF23,Klotho)孵育過夜,洗膜,室溫下二抗溶液(羊抗兔IgG)孵育45 min,洗膜,曝光,以β-actin為內參,將膠片進行掃描,用凝膠圖像處理系統(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶的光密度值。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清肌酐、尿素氮、鈣、磷水平比較 研究結果顯示,與空白組比較,模型組血清肌酐、尿素氮、磷均顯著增高(P<0.05),血鈣降低(P>0.05);中藥高劑量組血清肌酐、尿素氮、血鈣顯著增高(P<0.05),血磷升高(P>0.05);中藥中劑量組、中藥低劑量組血清肌酐、尿素氮、磷顯著升高(P<0.05或P<0.01),血鈣升高(P>0.05)。與模型組比較,中藥高劑量組血清肌酐、尿素氮、鈣、磷均顯著改善(P<0.05);中藥中劑量組血清肌酐、尿素氮、磷下降(P>0.05),血鈣增加(P<0.05);中藥低劑量組血清肌酐、尿素氮、鈣、磷下降(P>0.05)。與中藥低劑量組比較,中藥高劑量組血清肌酐、尿素氮顯著下降(P<0.05),血鈣上升(P>0.05),血磷下降(P>0.05);中藥中劑量組均有改善(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清肌酐、尿素氮、鈣、磷水平比較

2.2 各組大鼠腎臟FGF23、Klotho蛋白表達的比較 研究結果顯示,與空白組相比,模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組FGF23、Klotho蛋白相對表達量均顯著下降;與模型組相比,中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組FGF23、Klotho蛋白均有顯著改善。見表2、3、圖1、2。

A：空白組;B：模型組;C：中藥高劑量組;D：中藥中劑量組;E：中藥低劑量組

A：空白組;B：模型組;C：中藥高劑量組;D：中藥中劑量組;E：中藥低劑量組

表2 各組大鼠FGF23表達量

表3 各組大鼠Klotho蛋白表達量

3 討 論

中醫學古代文獻中沒有“慢性腎衰竭”的專屬病名,但與其相近的描述散見于“水腫”“癃閉”“腎風”“關格”“溺毒”“虛勞”等病癥中。如《證治匯補》中提出：“既關且格,必小便不通。”慢性腎衰竭具有較為復雜的病因病機,大多都由多病邪、多個臟腑同時致病,且以虛邪為主,夾以實邪,虛實夾雜,使病情遷延難愈,反復發作[7],臨床常見證型有肝腎陰虛、脾腎陽虛、濕毒內停等,但病因病機主要以腎虛、血瘀和濕毒為主。腎陰虧虛日久,陰損及陽而致陽虛,陽不化陰,使分泌清濁功能減退,導致濕濁潴留;肝陰虛使肝失于陰精濡養而致肝氣疏泄失常,氣機不利,更使濕濁之邪難以疏泄;腎陽虧虛無力溫煦脾土,則脾陽亦傷,脾陽虛運化失健,則瘀血內生,濕濁內停。肝、脾、腎三臟俱虛,氣機疏泄失常而致水濕、濁毒、瘀血停滯體內,三者又互相為病日久終致關格不通[8]。

《黃帝內經》提出水腫的治療原則 “平治于權衡,去菀陳莝,……開鬼門,潔凈府”,即以活血化瘀之法祛除瘀滯的痰濁瘀血,再加以補氣固本類藥物的推動,使邪氣從汗孔及膀胱排出。后世張仲景繼承發揚此理論,于《傷寒雜病論》中創造性地提出具體療法和方藥,近現代的醫家以此為理論基礎,結合各自臨床經驗,提出了活血通絡、清利濕熱、補氣養陰等方法,臨床應用皆取得了不錯的療效[9-10]。《金匱要略》中提出：“趺陽脈伏,水谷不化,脾氣衰則鶩溏,胃氣衰則身腫……經為血,血不利則為水,名曰血分。”《血證論》也提出：“血與水本不相離。”[11]由此可知,脾胃陽氣虧虛,運化水谷無力,氣血生化乏源,導致氣虛推動血行無力,產生瘀血,瘀血阻滯水道,水道不通,水失其道,同時脾胃五行屬土,土虛水侮,泛溢肌膚,導致水腫,離道之水阻滯經絡,經絡不通,又會導致瘀血的形成,加重水腫,故曰血瘀可導致水氣停聚化為濕濁,濕濁亦可導致血瘀,瘀血與濕濁相互影響,互為病理產物[12]。“去菀陳莝”是中醫活血化瘀治水法的來源,當取“活血化瘀,利濕化濁”之義。“久病必治絡[13]”,注重并活用活血化瘀之法,在CKD患者的治療當中,尤其是久病患者,往往可以提高臨床療效,減輕患者痛苦。

解毒活血湯在古籍中記載為用于熱毒血瘀之證的治療[14]。連翹清熱解毒,柴胡、葛根可升提陽氣以助正氣,也可助連翹發揮其效,當歸、生地活血滋陰,赤芍、桃仁、紅花可活血化瘀,枳殼理氣行氣,甘草可調和諸藥。現代藥理學研究表明,連翹可以抗氧化、緩解疲勞、降脂、抗炎、抗菌[15],柴胡具有抗癌、鎮痛、抗炎以及保護腎臟和降脂的作用[16],葛根能夠抗炎、抗氧化、減輕細胞的損傷[17],當歸、生地具有抗炎、保護肝臟與腎臟功能的作用[18],赤芍防止血栓、減少炎癥因子產生[19],桃仁抗炎、促進血液循環、改善血管壁的彈性、保護肝腎[20],枳殼降低血脂、抗腫瘤、抗炎、保肝[21],甘草可以保護肝腎、抗炎和抗過敏[22],紅花藥理作用具有多樣性,可以調節免疫功能[23]。該方以“去菀陳莝”理論為指導,全方起到清熱解毒、涼血活血化瘀的作用,對CKD患者療效甚好。

FGF23-Klotho軸通路與CKD患者鈣磷平衡關系密切,與CKD后期導致的眾多并發癥有著緊密的聯系,這也使得Klotho-FGF23軸有成為CKD防治的新靶點的可能性[24]。FGF23是成纖維細胞生長因子系列中的一種,可參與血磷的調節,CKD早期即開始升高,相關實驗研究結果表明敲除小鼠FGF23基因會導致其發生鈣磷代謝紊亂。另有研究表明,FGF23的過表達會抑制磷在腎小管的重吸收和鈣、磷在腸道的重吸收過程,導致尿磷增加與甲狀旁腺功能亢進,導致低磷血癥、骨軟化等病癥的發生[25]。臨床研究發現,Klotho蛋白具有調節高表達磷水平的能力,這種能力是通過降低腸道細胞與近端小管中相關蛋白的合成量發揮作用的,增加尿磷的排泄,使機體血磷濃度下降[26]。但隨著病情的不斷發展,殘余的腎單位不斷減少,使磷排泄障礙,最終導致高磷血癥發生。 Klotho蛋白也可通過抑制相關的轉運蛋白的表達來調控血磷的濃度,如NaPi2a;但其在機體中的高表達以及分泌的減少都會降低FGF23對血磷的調控能力。膜型α-Klotho蛋白可以和成纖維生長因子受體結合,形成FGF23的跨膜協同受體,增強FGF23-Klotho軸的功能,從而調節鈣磷,但隨著CKD的進展,FGF23表達持續升高,Klotho蛋白表達持續下降,使跨膜協同受體減少無法滿足FGF23的結合需要,產生FGF23抵抗,所以可通過調節失衡的FGF23-Klotho軸以達到改善機體高磷低鈣的狀態。

在本次實驗中我們可以發現,和模型組相比,CKD大鼠腎功水平的改善與解毒活血湯濃度呈正相關,解毒活血湯的濃度越高,對降低CKD大鼠血清肌酐和尿素氮的效果越好;解毒活血湯的濃度越高,FGF23與Klotho蛋白在腎臟組織的表達量越高,進而使失衡的FGF23-Klotho軸趨向平衡,調節CKD大鼠的鈣磷代謝,使血鈣上升,血磷下降。

解毒活血湯可以改善CKD 大鼠腎臟功能,其可以通過提高CKD大鼠腎臟組織中FGF23、Klotho蛋白的表達影響失衡的FGF23-Klotho軸,進而調節CKD大鼠血中鈣、磷濃度,且對其作用效果與解毒活血湯劑量相關,但解毒活血湯如何影響Klotho、FGF23蛋白表達的機制的研究仍然不清,所以還需要大量的臨床研究與實驗研究來明確Klotho、FGF23蛋白對腎臟功能的調節機制,證實FGF23-Klotho軸作為CKD治療靶點的效果及安全性。