藍刺頭對去卵巢大鼠血清P1NP、β-CTX及TNF-α、IL-1β、IL-6的影響

方 婷, 董重陽,任存霞

(1.內蒙古醫科大學中醫學院,內蒙古 呼和浩特 010059;2.呼和浩特市中醫蒙醫醫院,內蒙古 呼和浩特 010010)

絕經后骨質疏松癥(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)常發病于女性絕經后5～10年內,以骨皮質變薄及骨密度減低為主要病理改變,以雌激素水平下降為主要病因,中晚期出現疼痛、骨折為主要癥狀的代謝性骨病[1]。本病嚴重地影響老年人的身體健康和生活質量。傳統醫學中的很多藥物都是來自于天然,如果能從這些傳統民族藥物中發現能夠防治PMOP的藥材,對其不斷研究,相信PMOP給患者帶來的痛苦一定會得到減輕,且防治同時不會引起機體其他病變。諸多文獻表明蒙藥亦能夠有效的提高PMOP患者的骨密度、改善全身疼痛等癥狀,且具備資源豐富、療效顯著、不良反應少等優勢,治療 PMOP方面值得推廣。蒙藥藍刺頭(Echinops latifolius)首次記載于蒙醫醫典《智慧文鑒》中,其藥性涼,味苦,功效為接骨、愈傷、固骨質、清熱和止痛。臨床中常用于骨傷熱、筋骨折傷、金創及疼痛等病癥的治療[2]。近年來研究發現其在防治PMOP方面療效確切,且靶點豐富,機制清楚。骨代謝標志物Ⅰ型前膠原N端前肽(P1NP)和Ⅰ型膠原羧基端肽 β 特殊序列 (β-CTX)是監測骨轉換的重要指標,具有特異性強、靈敏度高的特點,近年來應用日趨廣泛。炎癥反應已被證實可以導致過度的骨吸收進而破壞骨平衡[3]。基于以往研究,本文研究了蒙藥藍刺頭對去卵巢大鼠血清骨代謝標志物P1NP和β-CTX以及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的影響,主要目的為闡明其抗骨質疏松作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器：本研究所用主要儀器包括臺式離心機(TGL-16c上海安亭科學儀器廠),酶標分析儀(AMR-100 杭州奧盛儀器有限公司),正置顯微鏡(NIKON ECLIPSE CI日本尼康公司)等。

1.1.2 主要藥品與試劑：蒙藥藍刺頭煎湯按 4∶2∶1 的比例制備為高、中、低劑量組;淫羊藿(Herb epimedii)顆粒,由廣東一方制藥有限公司生產,產品批號：A2025881。大鼠P1NP ELISA試劑盒(MM-20710R1酶免生物),大鼠β-CTX ELISA試劑盒(MM-20172R1酶免生物),大鼠TNF-α試劑盒(MM-0180R1酶免生物),大鼠IL-6試劑盒(MM-0190R1酶免生物),大鼠IL-1β試劑盒(MM-0047R1酶免生物)等。

1.1.3 實驗動物：4月齡清潔級健康雌性SD系未孕大鼠72只,重量為(250±20)g,購買于內蒙古醫科大學實驗動物中心,實驗動物生產許可證號為SYXK(蒙)2020-0003。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、造模與給藥：將72只大鼠常規飼養7 d后按照隨機數字表法分為假手術組、模型組、藍刺頭高劑量組、藍刺頭中劑量組、藍刺頭低劑量組、淫羊藿組,共六組,每組12只。選取大鼠卵巢摘除法(去勢)制備絕經后骨質疏松癥大鼠模型[4]。異氟烷吸入麻醉后,開腹找到卵巢,進行切除、結扎止血,最后將腹腔內容物復位,逐層縫合,消毒處理。假手術組只切除卵巢周圍少量脂肪組織。參照人鼠體重比例及人鼠代謝比率計算：藍刺頭高中低劑量組分別為：13、6.5、3.25 mg/ml。其中藍刺頭低劑量組為臨床等效劑量。淫羊藿組給藥劑量為成人的有效劑量：23.4375 mg/ml。除外模型組和假手術組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃。其余組灌胃體積以大鼠體重每100 g/2 ml計算得出,每天1次,連續3個月。

1.2.2 大鼠造模成功的判定：觀察陰道脫落細胞是用于判斷嚙齒動物的動情周期的一種可靠方法[5],實驗大鼠在造模后4 d內行陰道涂片以判斷造模是否成功。

1.2.3 大鼠股骨近端骨密度的檢測：末次灌胃1 d后,各組大鼠予以腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉,采血取骨,應用Micro-CT檢測大鼠處理后的右側股骨近端骨密度(BMD)。

1.2.4 血清P1NP、β-CTX檢測：用酶聯免疫法(ELISA法)測定血清P1NP、β-CTX的含量。于腹主動脈采血約6 ml,4 ℃冰箱靜置2 h后進行離心(3000 r/min),20 min后收集血清,按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 血清TNF-α、IL-1β、IL-6檢測：采用酶聯免疫法(ELISA法)測定血清TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。于腹主動脈采血約6 ml,4 ℃冰箱靜置2 h后進行離心(3000 r/min),20 min后收集血清,按照試劑盒說明書操作。

1.3 統計學方法 使用SPSS 25.0統計學軟件進行統計分析。實驗先進行正態性檢驗和方差齊性檢驗,符合正態分布和方差齊條件時兩組間比較應用t檢驗,不符合正態分布和方差不齊時采用校正的t檢驗;α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 陰道脫落細胞觀察 結果顯示：大鼠正常的動情周期包括動情前期、動情期、動情后期、動情間期,持續4～5 d。本次研究中假手術組可見動情周期規律交替,持續4 d;模型組4 d之內未出現動情周期規律性變化,提示PMOP大鼠模型造模成功[6](圖1)。

圖1 大鼠陰道脫落細胞涂片(HE染色,×100)

2.2 各組大鼠BMD測定結果 與假手術組相比,模型組大鼠股骨近端的BMD明顯下降(P<0.05);與模型組相比,藍刺頭高劑量組、藍刺頭中劑量組、藍刺頭低劑量組、淫羊藿組的BMD均有升高(P<0.05)。見圖2、3、表1。

表1 各組大鼠股骨近端BMD(mg/cm3)

圖2 假手術組股骨近端Micro-CT顯示圖

圖3 模型組股骨近端Micro-CT顯示圖

2.3 各組大鼠血清P1NP和β-CTX測定結果 與假手術組相比,模型組的P1NP和β-CTX顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,藍刺頭高劑量組、藍刺頭中劑量組、藍刺頭低劑量組和淫羊藿組P1NP和β-CTX均下降(P<0.05),但以藍刺頭高劑量組下降最明顯。說明蒙藥藍刺頭對于P1NP和β-CTX的影響趨勢為劑量依賴型。見表2。

表2 各組大鼠血清P1NP、β-CTX含量比較

2.4 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α測定結果 與假手術組相比,模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比,各組IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度均降低(P<0.05)。藍刺頭高劑量組與中劑量組比較無統計學差異(P>0.05)。藍刺頭低劑量組與淫羊藿組比較無統計學差異(P>0.05)。高、中劑量組藍刺頭降低PMOP模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β濃度的藥效強于淫羊藿。見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度比較(ng/L)

3 討 論

蒙醫學在治療PMOP方面有其獨特的自身優勢,具有療效與安全兼備的特點,其發展前景廣闊。傳統蒙醫學認為骨質疏松癥(Osteoporosis,OP)的發病原因主要在于腎虛則骨濡養不及而出現骨枯,治療原則宜以“補暖補精、抑赫依過剩、固骨質”為主。經過眾多醫家多年以來針對蒙藥藍刺頭的臨床運用探索,發現其對PMOP的防治不僅效果明顯,而且安全、不良反應少,作用機制豐富獨特,主要包括抗炎、抗氧化應激、增加骨量、減少骨丟失和雌激素樣作用[7]。

骨代謝平衡是成骨細胞與破骨細胞之間的一種動態狀態,當這種狀態被破壞后就會致使骨重建及代謝失衡,誘發多種骨病[8]。P1NP及β-CTX是兩種具有高度敏感性的骨代謝標志物[9],是衡量骨轉換的敏感指標,可以反映骨代謝過程[10-11]。而BMD一般要在治療6個月后才能用以評判療效[12-13],因此在監測療效方面,骨代謝標志物有著重要意義。可以通過檢測血清中這些指標的變化來早期判斷骨重塑的情況。P1NP 是由活化的成骨細胞釋放,其在血清中的含量可以反映成骨細胞合成骨膠原的能力[14],是骨形成的敏感指標;而β-CTX 是在骨吸收過程中Ⅰ型膠原分解后釋放入血的一種片段,可以用以判斷破骨細胞的活性,是骨吸收的特異指標[15]。研究顯示與非骨質疏松患者相比,骨質疏松患者的P1NP和β-CTX明顯升高[16]。本實驗結果顯示：與假手術組相比,模型組大鼠P1NP和β-CTX均升高。這也與趙和平[17]研究結果一致：PMOP患者血清P1NP、β-CTX水平高于正常者。而經蒙藥藍刺頭治療90 d后,其各劑量組血清P1NP、β-CTX水平均有下降,且為劑量依賴型。表明蒙藥藍刺頭可以抑制骨吸收,增加骨量,有助于維持骨代謝平衡,進而防治PMOP。

PMOP 發病涉及系統性炎癥激活[18]。而炎癥反應已被證實可以導致過度的骨吸收進而破壞骨平衡[19]。IL-6和TNF-α是強烈的骨吸收刺激因子,TNF-α在破骨細胞生成中起著正向作用,可以促進骨吸收,引起骨量減少[20]。IL-6 可直接作用于成骨細胞,抑制其活性,減少骨形成;也可以促進破骨細胞生成,加強骨吸收,加重骨量流失,誘發骨質疏松[21]。有學者指出,IL-6、TNF-α對骨吸收具有增益效應[22]。IL-1β也是PMOP的誘因之一,當絕經后體內雌激素水平下降時,一方面IL-1β降低骨保護素的表達,進而抑制骨形成;另一方面IL-1β 也可直接通過RANKL誘導破骨細胞的分化成熟,促進骨吸收。研究發現：經雌激素治療后的PMOP患者體內IL-1水平低于未經治療的PMOP患者[23]。在本實驗中,研究結果顯示：摘除卵巢后的大鼠模型體內的TNF-α、IL-6、IL-1β的含量高于假手術組,這正與袁顯群[24]的實驗結果吻合。而經過蒙藥藍刺頭治療后的大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β明顯下降,并且低劑量的蒙藥藍刺頭與淫羊藿在降低PMOP模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β的藥效相當。高小明等[25]通過實驗也證明蒙藥藍刺頭可以降低去勢模型大鼠的炎癥因子含量。而本實驗研究說明：蒙藥藍刺頭各劑量組可以通過降低PMOP患者血清炎性因子的含量,進而減少骨吸收,促進骨形成,增加骨量,達到防治PMOP的作用。