遠海梭子蟹TTK 基因測序與分析*

齊樂鳳，苗貴東，2，錢慶忠，李 浩

（1.黔西南州生物遺傳資源挖掘與分子育種重點實驗室，貴州 興義 562400；2.興義民族師范學院生物與化學學院，貴州 興義 562400）

遠海梭子蟹（Portunus pelagicus） 俗稱藍花蟹，屬于梭子蟹屬的甲殼類動物。出肉率可觀，肉質鮮甜，可供出口外匯，具有極高的發展前景[1]，是我國重要的經濟蟹類之一[2]。隨著科技的發展，我國對遠海梭子蟹的研究也迎來黃金發展時期，在遠海梭子蟹的人工育苗[3-4]、生長發育[5]、生活習性[6]、繁殖[7]、生物學探究[8]、貯藏條件[9]、遺傳物質核酸等都有基礎的報道[10]。研究遠海梭子蟹的生長發育、生物習性以及生物調控分子機制，不僅從生物學角度，而且從遺傳機制角度，解釋其發育規律，從而為遠海梭子蟹資源的可持續開發以及利用，提供重要的遺傳學基礎。

蘇氨酸酪氨酸激酶（Threonine and Tyrosine Kinase，TTK） 是一種雙特異性激酶，與細胞增殖有關，在細胞的有絲分裂過程中對染色體的排列組合具有促進作用[11]。其基因轉錄產物是重要的轉錄因子，對生物體的發育、分化、性行為等有著調控作用[12]，當分裂出錯時，TTK 就起著糾正的功能，直到細胞正常分裂結束[13]。當前TTK 基因的研究報道豐富，但卻并無遠海梭子蟹TTK 基因的研究報道，因此開展遠海梭子蟹TTK 基因基礎研究具有較高的價值。

1 遠海梭子蟹TTK 基因測序與分析的實驗材料與方法

實驗所用遠海梭子蟹個體采自廣西北海海域，按照蟹類樣品取樣規范，經處理后保存備用。在實驗室遠海梭子蟹cDNA 文庫中找到TTK 基因的基因全長序列，利用軟件Premier 5.0 設計上游、下游引物，通過PCR 反應進行驗證口基因序列，從而進行分析。

2 遠海梭子蟹TTK 基因測序與分析的實驗結果

2.1 遠海梭子蟹DNA 的提取及測序驗證

使用天根海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒提取的遠海梭子蟹基因組DNA 用于后續實驗。由于遠海梭子蟹TTK 基因序列長度為3260 bp，因此將其序列分為多個部分進行雙向測序。對篩選得到的基因組DNA 通過引物進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳后經凝膠成像系統得到PCR 產物的凝膠電泳結果，見圖1。將目標產物送生工生物工程（上海） 股份有限公司進行測序。測序結果返還后進行序列組裝與拼接，與實驗室已有TTK 基因序列進行比對，測序比對結果見圖2。由圖2 可知，比對一致性為99.45%，表明三代測序結果質量可靠，可用于后續基因結構與功能預測分析。

圖1 PCR 產物的凝膠電泳結果

圖2 測序比對結果

2.2 生物信息學分析

2.2.1 序列比對

將拼接序列上傳至NCBI Blast 進行比對，確定結果的可信度并使用NCBI ORF finder 確定TTK 基因的開放閱讀框，結果表明TTK 基因的開放閱讀框長度為1752 bp，起始密碼子ATG，終止密碼子TGA，共編碼了583 個氨基酸。運用DNAMAN 軟件對CDS 序列進行堿基組成分析，分析顯示TTK基因的CDS 序列中堿基A（26.0%）、T（18.3%）、G（27.6%）、C（28.2%），其中GC 含量超過50%，序列結構穩定性高。

2.2.2 氨基酸序列相似性比較及進化樹

利用MegAlign 工具對TTK 基因進行氨基酸序相似性分析，遠海梭子蟹蛋白質序列同源比對統計結果見圖3。分析得出三疣梭子蟹、斑節對蝦、南美白對蝦的氨基酸序列相似性都超過90%，相似性高；四爪螯蟹、桑蠶、日本對蝦、中國對蝦、克氏原螯蝦的氨基酸序列相似性較低，在80%以下。運用MEGA11 軟件作出遠海梭子蟹TTK 基因系統進化樹，見圖4。分析得出遠海梭子蟹與三疣梭子蟹親緣關系最近，與中華絨螯蟹、角藻親緣關系較近，與中國對蝦、日本對蝦、斑節對蝦、四爪螯蟹、南美白對蝦、克氏原螯蝦親緣關系較遠，符合傳統進化規律。

圖3 遠海梭子蟹蛋白質序列同源比對統計結果

圖4 遠海梭子蟹TTK 基因系統進化樹

2.2.3 TTK 基因蛋白表達預測分析

通過ExPASy-ProtParam 在線工具分析可知，TTK 序列帶負電荷的氨基酸數（Asp+Glu） 85；帶正電荷的氨基酸數（Arg+Lys） 61；氨基酸組成中絲氨酸占比最多，為10.1%；色氨酸占比最少，僅有0.5%。

運用TMHMM2.0 對TTK 蛋白質進行跨膜區預測，見圖5，結果顯示該蛋白質不存在跨膜區。運用SignaIP6.0 在線軟件對TTK 蛋白質進行信號肽預測，見圖6，結果顯示TTK 蛋白質不存在信號肽。

圖5 TTK 蛋白質跨膜區預測

圖6 TTK 蛋白質信號肽預測

通過NetPhos3.1 在線軟件預測遠海梭子蟹TTK蛋白質發現，預測結果顯示該蛋白質的磷酸化位點有64 個，其中絲氨酸磷酸化位點47 個，蘇氨酸磷酸化位點17 個，見圖7。

圖7 TTK 蛋白質磷酸化位點預測

使用在線工具SOPMA，對TTK 蛋白質進行二級結構預測，見圖8。結果表明α-螺旋、延伸鏈、β-折疊、無規則卷曲占比分別為30.87%、7.38%、6.00%、55.75%。使用SWISS-MODEL 在線工具進行三級結構的建模分析得出TTK 蛋白質的GMQE值為0.10，QMEAN 值為-3.17。TTK 蛋白三級結構預測顯示該蛋白的空間結構主要由α-螺旋和無規則卷曲組成，見圖9。

圖8 TTK 蛋白質二級結構預測結果

圖9 TTK 蛋白質三結構預測

3 討論與結論

本實驗對遠海梭子蟹中的TTK 基因進行基礎研究。得到TTK 基因CDS 序列為1752 bp，CDS 同源性分析得出與三疣梭子蟹的同源性最高；進化樹分析得到遠海梭子蟹與三疣梭子蟹的同源性最高，與中國對蝦、日本對蝦、斑節對蝦、四爪螯蟹、南美白對蝦、克氏原螯蝦親緣關系較遠，符合傳統進化規律；序列編碼氨基酸583 個，其中負電荷的氨基酸數（Asp+Glu） 85，帶正電荷的氨基酸數（Arg+Lys） 61，氨基酸組成中絲氨酸占比最多，為10.1%，色氨酸占比最少，僅有0.5%；TTK 蛋白質不存在跨膜區和信號肽；序列的理論等電點5.19，氨基酸平均親水性-0.808，是親水蛋白質；序列中磷酸化位點64 個，其中絲氨酸磷酸化位點47 個，蘇氨酸磷酸化位點17 個；蛋白質二級結構中α-螺旋、延伸鏈、β-折疊、無規則卷曲占比分別為30.87%、7.38%、6.00%、55.75%。本實驗通過高通量測序對遠海梭子蟹TTK 基因序列進行驗證和基礎分析，對其蛋白質的結構和功能進行了初步的驗證和分析，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎并提供了一定參考，對甲殼類生物TTK 基因的后續研究具有較高意義。