正交優(yōu)化超聲輔助法提取土黨參中黨參炔苷的工藝研究

陸廷祥，韓忠耀，徐英志，劉明濤，劉承貴，黃華軍

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州 都勻 558013)

土黨參為桔梗科金錢豹屬植物金錢豹(CampanμmoeajavanicaBL.)的干燥根，主產(chǎn)于我國(guó)貴州、四川、湖北、湖南等地[1]。土黨參作為藥食同源植物，目前已列入貴州省苗族等少數(shù)民族藥材目錄，收錄于《貴州省中藥材及民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003年版)[2]。土黨參以野生為主，資源蘊(yùn)藏量低[3]，其性平味甘，歸脾、肺經(jīng)，有補(bǔ)中益氣，潤(rùn)肺生津，止血，通乳之功效，常用于治療虛勞內(nèi)傷，脾虛泄瀉，肺虛咳嗽，乳汁不多，小兒疳積，小兒遺尿[4]。由于土黨參功效顯著，現(xiàn)已被開發(fā)為多種制劑及列入保健品專利[5-7]。

土黨參中主要化學(xué)成分為黨參炔苷、多糖、甾體、三萜、黃酮、蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)[8-10]，藥理研究表明黨參炔苷有促進(jìn)潰瘍愈合，修復(fù)胃黏膜損傷[11]的作用，與其補(bǔ)中益氣的功效相符，土黨參多糖具有保護(hù)腦損傷、提高學(xué)習(xí)記憶力、抗疲勞、抗缺氧、抗腦缺血[12-15]等生物活性。

目前，對(duì)土黨參中活性物質(zhì)黨參炔苷的提取工藝未見報(bào)道，對(duì)其開展深入研究，有助于更好的開發(fā)利用土黨參資源。由于黨參炔苷屬于聚乙炔類化合物，含共軛三鍵，具有不飽和性，易發(fā)生加成、氧化等反應(yīng)，故提取工藝對(duì)黨參炔苷的提取有重要的影響。超聲波輔助提取技術(shù)是近年來(lái)中藥材提取常用的一種新技術(shù)，具有提取率高、提取速度快的優(yōu)點(diǎn)。因超聲波可在液體中有效的攪動(dòng)與流動(dòng)，使樣品破碎，減小顆粒大小，擴(kuò)大樣品與溶劑的接觸面積，從而提高傳質(zhì)速率，使被測(cè)組分快速轉(zhuǎn)入溶劑中，促進(jìn)樣品中有效成分與提取溶劑充分混合，達(dá)到快速提取[16-17]。本文應(yīng)用超聲波輔助技術(shù)對(duì)土黨參中的黨參炔苷進(jìn)行提取，以黨參炔苷的含量為考量指標(biāo)，分別進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，從而對(duì)土黨參中黨參炔苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 土黨參采集于貴州省都勻市勻東鎮(zhèn)，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校王傳明副教授鑒定為金錢豹(CampanμmoeajavanicaBL.)的根；黨參炔苷對(duì)照品(批號(hào)：CHB180122，純度：≥98%)：成都克洛瑪生物科技有限公司；乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為娃哈哈純凈水。

Agilent 1260高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器，四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，美國(guó)安捷倫科技公司)；AS10200A型超聲儀(杭州匯爾公司)；DV215CD電子分析天平(d=0.000 01 g，美國(guó)OHAΜS公司)；AE240電子分析天平(d=0.000 1 g 瑞士METTLERTOLEDO公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱101-3AB型(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為DiamonsiL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)(18∶82)；檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm；流速：1 ml·min-1；柱溫：30℃。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黨參炔苷對(duì)照品，置于25 ml棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，搖勻，即得濃度為0.252 0 mg·ml-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

1.2.3 樣品預(yù)處理 土黨參凈選后，切制成厚片，置于電熱干燥烘箱中60℃烘烤8 h；干燥后，用粉碎機(jī)磨細(xì)，過(guò)60目標(biāo)準(zhǔn)分樣篩備用。

1.2.4 土黨參供試品溶液的制備 精密稱取“1.2.3”項(xiàng)樣品1 g，置于具塞錐形瓶中，加入設(shè)定濃度和體積的溶劑，按照設(shè)定的溫度、時(shí)間進(jìn)行超聲提取；將提取液放置于離心機(jī)中，以轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心5 min ，收集上清液，再加入同等濃度的甲醇定容至100 ml，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液得到供試品溶液。

1.2.5 黨參炔苷含量的測(cè)定 (1)系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液10 μl，按“1.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1，結(jié)果表明，在此條件下，黨參炔苷分離度大于1.5，具有良好的分離效果。(2)線性關(guān)系考察。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：別取0.252mg·ml-1黨參炔苷對(duì)照品溶液 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 ml，置于10 ml棕色容量瓶，用甲醇稀釋至刻度。按“1.2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以黨參炔苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=1 404x-16.24，R2=0.999 9，表明黨參炔苷質(zhì)量濃度在0.012 6～0.201 6 mg·ml-1范圍內(nèi)，有良好的線性關(guān)系。精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的方法及結(jié)果見參考文獻(xiàn)[18]，結(jié)果表明所用儀器精密度良好，供試品溶液中的黨參炔苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性，該實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。加標(biāo)回收率：取同一批次土黨參樣品，按“1.2.4”中方法制備6份樣品溶液，分別精密加入1.8 mg黨參炔苷標(biāo)準(zhǔn)品，制成加標(biāo)回收率供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算樣品中黨參炔苷的回收率，結(jié)果見參考文獻(xiàn)[18]，結(jié)果表明該樣品中黨參炔苷平均加標(biāo)回收率為98.8%，RSD為1.02%(n=6)，符合要求。(3)黨參炔苷含量的測(cè)定。移取供試品溶液，按照“1.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)公式計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)中土黨參中黨參炔苷的含量。黨參炔苷的含量(mg·g-1)=CV/M式中：C為提取液中黨參炔苷的濃度(mg·ml-1)；V為提取液的最終體積(ml)；M為土黨參樣品的質(zhì)量(g)。

圖1 黨參炔苷對(duì)照品(a)和供試品(b)溶液的HPLC色譜圖

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)考察 (1)甲醇濃度的影響 設(shè)定超聲溫度40℃，料液比1∶40 (g·ml-1)，提取時(shí)間40 min。甲醇濃度分別取50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，研究甲醇濃度與黨參炔苷含量的變化趨勢(shì)。(2)料液比的影響 設(shè)定超聲提取溫度40℃，甲醇濃度60%，提取時(shí)間40 min。料液比分別取1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g·ml-1)進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，研究料液比與黨參炔苷含量的變化趨勢(shì)。(3)提取溫度的影響 設(shè)定甲醇濃度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)、提取時(shí)間40 min。提取溫度分別取10、20、40、60、80℃進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，研究提取溫度與黨參炔苷含量的變化趨勢(shì)。(4)提取時(shí)間的影響 設(shè)定甲醇濃度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)、提取溫度40℃。提取時(shí)間分別取10、20、30、40、50 min進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，研究提取時(shí)間與黨參炔苷含量的變化趨勢(shì)。

1.2.7 土黨參黨參炔苷超聲波輔助提取工藝優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，確定各單因素的最優(yōu)工藝水平，選擇甲醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間作為考察因素，以土黨參黨參炔苷含量為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)L9(34)選取的最佳工藝條件。設(shè)計(jì)的因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

通過(guò)表3中試驗(yàn)數(shù)據(jù)中K值和R值的大小分析可知，當(dāng)組合為A1B2C3D2時(shí)，黨參炔苷含量最大，由R值大小可知，影響黨參炔苷提取含量大小的因素主次順序B>C>D>A，即料液比影響較大，溫度次之，甲醇濃度較小，超聲時(shí)間影響最小，最優(yōu)組合A1B2C3D2。綜合各因素作用，最終選定土黨參中黨參炔苷的最優(yōu)提取工藝為：甲醇濃度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)，提取溫度60℃，提取時(shí)間40 min。由方差分析表3中試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，料液比、溫度達(dá)到顯著 (P<0.05)水平，表明料液比、溫度兩個(gè)因素均顯著地影響土黨參中黨參炔苷的含量。其他兩個(gè)因素?zé)o顯著性影響。

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 用試驗(yàn)結(jié)果中提取最優(yōu)的工藝條件：甲醇濃度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)，提取溫度60℃，提取時(shí)間40 min，同時(shí)制備6份平行試樣，測(cè)定黨參炔苷的含量，其平均含量為 2.989 mg·g-1，均高于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的9組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的黨參炔苷含量。結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

黨參炔苷作為土黨參的質(zhì)量評(píng)價(jià)重要指標(biāo)，有關(guān)文獻(xiàn)[20]報(bào)道使用甲醇溶劑提取黨參炔苷效果較好，采用甲醇溶劑對(duì)土黨參中黨參炔苷進(jìn)行含量測(cè)定[21]，但由于黨參炔苷對(duì)溫度較為敏感，高溫會(huì)影響其穩(wěn)定性[22]。本實(shí)驗(yàn)為了優(yōu)化土黨參中黨參炔苷的提取工藝，以黨參炔苷含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到最優(yōu)工藝為甲醇濃度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)，提取溫度60℃，提取時(shí)間40 min，此條件下，黨參炔苷含量高達(dá)2.989 mg·g-1。通過(guò)方差分析，料液比和溫度兩因素為顯著因素，這是因?yàn)辄h參炔苷的結(jié)構(gòu)式中有易發(fā)生氧化還原反應(yīng)的炔鍵，所以分子極性偏大。在提取工藝設(shè)計(jì)過(guò)程中，特設(shè)定溫度因素，是為了驗(yàn)證溫度的影響，同時(shí)有利于找出較合適的提取溫度。

前期實(shí)驗(yàn)組分別采用回流提取法、超聲提取法及微波提取法進(jìn)行對(duì)比研究，前兩種提取方法較好，且含量相差微小。故采用超聲提取法，它消耗時(shí)間短，適應(yīng)性廣，且成本低，易于操作，節(jié)約資源的優(yōu)勢(shì)，為土黨參中黨參炔苷的提取工藝提供了參考，為有效地控制土黨參質(zhì)量提供依據(jù)。