甘蔗轉錄因子DREB2 基因的克隆和生物信息學分析*

賈晨灝，夏可燦，2，錢慶忠，李 浩，黎慧敏，苗貴東，2

（1.興義民族師范學院生物與化學學院，貴州 興義 562400，2.黔西南州生物遺傳資源挖掘與分子育種重點實驗室，貴州 興義 56240）

我國甘蔗區種植面積70%以上為旱坡地，甘蔗區條件逐漸由水田向高海拔、低降雨量、土壤貧瘠的旱坡地轉移。干旱已成為我國甘蔗單產低、品質差的主要原因之一。如何解決干旱脅迫下甘蔗的產量問題是目前生產上面臨的重要課題。甘蔗作為一種高度雜合、遺傳背景復雜的無性繁殖作物，常規的抗旱選育方法盲目性大，周期長，效果也有限。隨著分子輔助育種的快速發展，從分子水平改良品種抗旱性成為了可能，可以在很大程度上克服常規抗旱育種中的一些問題，從而提高育種效率，加速抗旱甘蔗品種的培育和推廣。

干旱應答元件結合蛋白（Dehydration Responsive Element Binding Protein，DREB） 轉錄因子屬于AP2/EREBP 轉錄因子家族，具有一個典型的AP2/EREBP 保守結構域[1]，由60-70 個氨基酸組成，能夠特異性結合DRE 順式作用元件，調控與干旱、高鹽、高滲、極端溫度等非生物脅迫應答有關的基因表達，從而增強植物對多種脅迫的抵抗性。DREB 亞族家族具有6 個組，即A1～A6[2]。

自1997年首次從擬南芥基因中分離到編碼DREB 蛋白質的CBF1 基因[3]以來，現已從擬南芥、水稻等植物中分離出DREB 類轉錄因子[4]。2007年，福建農林大學農業部甘蔗生理生態與遺傳改良重點實驗室克隆到甘蔗近緣屬斑茅的DREB 基因同系物EaDREB2B，通過擬南芥誘導型啟動子rd29A 驅動其在甘蔗中表達，獲得了抗旱的轉EaDREB2B 基因甘蔗無性系，檢測結果表明該基因在轉基因甘蔗中能穩定表達，并提高甘蔗的抗旱能力[5]。同時，中國熱帶農業科學院湛江實驗站劉洋博士團隊以割手密為材料，采用同源基因克隆的方法獲得2 個DREB2類轉錄因子SsDREB2-a 和SsDREB2-f（Gen Bank登錄號分別為KU963272 和KU963277）[6]。鑒于DREB 基因在植物非生物脅迫抗性過程中起著重要作用，本研究利用同源基因克隆技術從甘蔗品種中獲得1 個ScDREB2 基因，比較分析獲得的序列，以期為后續該基因在甘蔗抗逆育種上的開發利用和分子調控機制研究奠定理論基礎和提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以F113 甘蔗品種為材料，由國家甘蔗種質資源圃提供。

1.2 甘蔗葉片總DNA 提取

葉片總DNA 的提取采用天根植物基因組DNA提取試劑盒（Plant Genomic DNA kit）。

1.3 ScDREB2 基因克隆

參考姚艷麗等[6]在割手密上設計的兩對特異引物，以DNA 為模板，采用巢式PCR 進行擴增。PCR 經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit 回收，使用pEASY- Blunt Zero Cloning Kit 將回收的擴增產物連接、轉化到Trans1-T1 感受態細胞中，陽性克隆經菌落PCR 鑒定后，再轉入含氨芐青霉素的培養基中37 ℃培養12 h，至少挑取40 份克隆，送生工生物工程（上海） 股份有限公司測序。

1.4 生物信息學分析

使用ExPASy 在線平臺的ProtParam tool 在線預測甘蔗DREB2 蛋白質的等電點和相對分子質量，ProtScale 進行疏水性/親水性預測，SignaIP 5.0 軟件預測信號肽、NetNGlyc-1.0 及YinOYang-1.2 進行N-糖基化位點預測和O-糖基化位點預測、NetPhos3.1 進行磷酸化位點預測，運用SOPMA 在線服務器進行蛋白二級結構分析，SWISS-MODEL進行蛋白三級結構分析，采用SMART 在線預測網站進行結構域與功能區分析。使用DNAstar 軟件包中的MagAlign 程序進行同源性比對，使用MEGA 11.0 軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 ScDREB2 基因的克隆及序列分析

ScDREB2 基因PCR 擴增瓊脂糖凝膠電泳檢測見圖1。從甘蔗中擴增得到的ScDREB2 基因，序列長度為1537 bp，通過NCBI 網站的ORF Finder 程序進行分析，測得其中包括789 bp 的開放閱讀框（ORF），整個ORF 編碼262 個氨基酸。

圖1 ScDREB2 基因PCR 擴增瓊脂糖凝膠電泳檢測

利用BLAST 程序發現所得目的基因同源序列與參考序列（KU963272 和KU963277） 覆蓋率為100%，相似性達97.73% （KU963272） 和95.93%（KU963277），經序列比對分析發現，該序列含有2 個外顯子和1 個內含子。

2.2 甘蔗ScDREB2 基因氨基酸序列同源進化分析

采用MEGA 11.0 軟件，將甘蔗DREB2 轉錄因子氨基酸序列與甜根子草、高粱等11 種植物的DREB2 蛋白氨基酸序列進行同源遺傳進化分析，見圖2。由圖2 可知，甘蔗與甜根子草被聚在同一亞類，因此，它們之間具有較高的同源性和較近的親緣關系。此進化樹與傳統形態學分類基本一致。進化分析表明，ScDREB2 基因編碼蛋白為DREB2蛋白為AP2/EREBP 類DREB 亞族家族A-2 組轉錄因子。圖3 為甘蔗DREB2 蛋白氨基酸序列。

圖2 甘蔗DREB2 蛋白氨基酸序列的同源遺傳進化分析

圖3 甘蔗DREB2 蛋白氨基酸序列

2.3 甘蔗ScDREB2 轉錄因子的生物信息學分析

2.3.1 甘蔗ScDREB2 轉錄因子的等電點和分子量預測

通過ExPASy 在線平臺的ProtParam tool 在線預測甘蔗ScDREB2 蛋白質的等電點和相對分子質量，見圖4。結果顯示，DREB 轉錄因子等電點為9.25和相對分子質量為26861.97。該蛋白質由3972 個原子組成，分子式為C1238H1958N360O406S10。其不穩定指數（Ⅱ）計算為43.95，為不穩定蛋白質。

圖4 甘蔗DREB2 蛋白質等電點和相對分子質量預測

2.3.2 甘蔗ScDREB2 轉錄因子親水性/疏水性分析

通過ExPASy 在線平臺上的ProtScale 對甘蔗ScDREB2 轉錄因子進行疏水性/親水性預測，見圖5。分析圖5 疏水性圖譜可知，多肽鏈的第234 位的異亮氨酸基（Ile） 具有最高的分值，為2.289，疏水性最強。第27 位的甲硫氨酸（Met），具有最低的分值，為-3.178；其次是第46 位的谷氨酸（Glu），為-3.056；以及第251 位的組氨酸（His），為-2.844。三者均為親水氨基酸。經過計算可知，甘蔗ScDREB2 轉錄因子呈親水性（Hydropathicity），為親水性蛋白。

圖5 甘蔗ScDREB2 轉錄因子的親水性/疏水性預測

2.3.3 甘蔗ScDREB2 轉錄因子活性位點預測分析

利用在線服務器SignaIP 5.0 預測信號肽、NetNGlyc-1.0 和NetOGlyc-4.0 預測N-糖基化位點和O-糖基化位點、NetPhos3.1 預測磷酸化位點，結果見圖6。擁有信號肽的概率為0.0022，可知DREB2 類轉錄因子不存在信號肽，為非分泌蛋白。甘蔗DREB2 類轉錄因子含有32 個O-糖基化位點，1 個N-糖基化位點，由于DREB2 蛋白質不存在信號肽，雖然預測圖上出現可能存在的1 個N-糖基化位點，但是因為沒有信號肽的蛋白質不太可能暴露于N-糖基化機制下，因此DREB2 蛋白質應不存在糖基化位點。

圖6 甘蔗ScDREB2 轉錄因子活性位點預測

分析圖6（d） 可知，其存在30 個磷酸化位點，其中17 個是絲氨酸（Ser），8 個是蘇氨酸（Thr），5 個是酪氨酸（Tyr）。

2.3.4 甘蔗ScDREB2 轉錄因子結構預測

甘蔗DREB2 類轉錄因子的二級結構預測見圖7；甘蔗DREB2 類轉錄因子的二級結構預測分析見表1。

表1 甘蔗DREB2 類轉錄因子的二級結構預測分析

圖7 甘蔗DREB2 類轉錄因子的二級結構預測

顯示該蛋白α 螺旋占比最高，占比為42.75%；其次為無規則卷曲、延伸鏈、β 折疊，占比分別為35.50%、12.98%、8.78%。建模以5wx9.1.A 序列作為模板，構建甘蔗DREB2 類轉錄因子三級結構，與目標序列的一致度為58.33%，遠大于30%，滿足同源建模的基本條件。甘蔗DREB2 類轉錄因子三級結構預測見圖8。

圖8 甘蔗DREB2 類轉錄因子三級結構預測

3 分析與討論

從DREB2 類轉錄因子首次被提取出來至今，短短幾十年已經從眾多植物中分離出DREB 轉錄因子，DREB 轉錄因子能夠與DRE/CRT 順式作用元件或具有DRE 元件核心序列（即TACCGACAT，其中CCGAC 是能特異性結合的最小序列[7]） 特異性結合，進而調控與干旱、高鹽、高滲、極端溫度等非生物脅迫應答有關的基因表達[8]，通過這些基因產物的表達以及協同作用綜合提高植物對逆境的抵抗能力[9]。

從種種事例來看，利用轉基因技術改良甘蔗遺傳性狀，可以顯著提高甘蔗抗旱性，具有良好的應用前景，是培育甘蔗良種的有力方法。仍存在轉基因技術尚未完全成熟、遺傳轉化率不高等問題，轉入的DREB 基因是否會對其他基因造成影響，目前也尚未知曉。但是轉基因技術依舊是培養良種的有力手段，未來，隨著測序技術發展，充分挖掘與了解DREB 轉錄因子，可提供充足的后選基因，利用基因工程，對培育抗旱性良好的甘蔗品種具有重要意義。