山奈酚對缺氧/復氧損傷誘導心肌細胞凋亡的影響及機制研究

武金盼,陳繼軍,袁 青,趙新春,何佩娟

(空軍軍醫大學西京醫院,陜西 西安 710032)

心肌缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury,IRI)發生機制復雜,其中心肌細胞在損傷后由于鈣超載引發的凋亡發揮重要作用[1-2]。山奈酚屬于黃酮類化合物,廣泛存在于多種草藥中[3]。目前已有報道,山奈酚可減少缺氧損傷、氧化應激損傷及炎癥刺激誘導的心肌細胞凋亡[4-6]。也有研究證實,山奈酚能夠通過抗炎作用增加缺氧/復氧損傷后心肌細胞的活性[7]。本研究利用缺氧孵箱和常規孵箱交替培養大鼠H9C2心肌細胞建立心肌細胞IRI模型,探究山奈酚對心肌細胞缺氧/復氧損傷誘導心肌細胞凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 DMEM細胞培養基、胰蛋白酶和10%胎牛血清等細胞培養試劑購自美國Gibco公司;山奈酚購自成都德斯特生物公司;流式細胞儀凋亡檢測試劑膜聯蛋白Annexin V和碘化丙錠(Propyl iodide,PI)購自江蘇博瑞金公司,鏡下凋亡檢測轉移酶介導的缺口末端標記(Transferase-mediated nick-end labeling,TUNEL)購自南京舟達生物科技公司;凋亡相關抗體anti-CASP3、anti-Bax、anti-Bcl-2和anti-GAPDH購自美國Abcam公司,鈣離子通道核心蛋白抗體anti-Cav1.2購自美國Alomone公司;細胞核熒光染料Hoechst33342和鈣離子熒光標記染料Fluo-4M購自上海博瑞德生物公司。常規細胞孵箱和缺氧孵箱(德國賀氏公司),流式細胞儀(美國賽默飛公司),熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司),電泳儀及發光儀(上海天能公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養:H9C2大鼠心肌細胞來自空軍軍醫大學航空航天生理學教研室惠贈。用含10%胎牛血清的DMEM培養基在常規孵箱中培養H9C2大鼠心肌細胞[8]。

1.2.2 造模、分組和給藥:利用缺氧孵箱和常規孵箱交替培養細胞,建立H9C2大鼠心肌細胞IRI(缺氧/復氧損傷)模型:利用缺氧孵箱(氧濃度為1%)培養細胞4 h后將細胞放入常規孵箱(氧濃度為21%)繼續培養4 h,以此方法建立IRI細胞模型[9]。

利用隨機數字法將H9C2大鼠心肌細胞隨機分為對照組、缺氧/復氧組和山奈酚組,對照組細胞在常規細胞孵箱中常規培養,缺氧/復氧組細胞按照上述造模方法培養,山奈酚組細胞是在缺氧孵箱培養H9C2大鼠心肌細胞4 h后,將培養基更換為含有30 μmol/L山奈酚的培養基[4-7],隨后放入常規孵箱繼續培養4 h。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡:利用胰蛋白酶收集各組細胞,離心后洗滌細胞3次,再次離心后利用無水乙醇固定細胞1 h,濾網過濾細胞后,利用染料Annexin V和PI避光反應30 min,調試流式細胞儀參數,激光波長為488 nm,發射波長為630 nm,上機檢測[10-11]。

1.2.4 TUNEL檢測細胞凋亡:利用TUNEL染色法對大鼠心肌細胞進行凋亡檢測,培養細胞清洗后利用蛋白酶K工作液在37 ℃下反應30 min,清洗后利用過氧化氫室溫反應10 min,清洗好細胞后利用TUNEL反應液在37 ℃下避光反應60 min,清洗后加入帶有熒光標記的反應液繼續反應,隨后封片在熒光顯微鏡下觀察[10-11]。

1.2.5 蛋白表達檢測:利用Western blot技術檢測大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白和鈣離子通道核心蛋白Cav1.2含量。利用蛋白裂解液裂解各組H9C2大鼠心肌細胞,在上述樣品中加入緩沖液,煮沸獲取蛋白樣品。經過電泳、轉膜、抗體孵育、發光等步驟后檢測蛋白含量[12]。anti-CASP3抗體按照1∶1000稀釋,anti-Bax抗體按照1∶5000稀釋,anti-Bcl-2抗體按照1∶5000稀釋,anti-GAPDH抗體按照1∶10000稀釋[10-11]。

1.2.6 細胞內鈣離子濃度[Ca2+]i檢測:利用鈣離子特異性熒光染料Fluo-4M標記各組心肌細胞,而后在熒光顯微鏡下記錄各組細胞熒光強度以此檢測[Ca2+]i。將各組細胞清洗3遍,加入Fluo-4M工作液,避光室溫孵育30 min,孵育后洗滌3遍,避光下熒光顯微鏡觀察并記錄[12]。

1.3 統計學方法 利用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析,兩樣本間比較利用獨立樣本t檢驗,三個樣本比較采用方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 流式細胞儀檢測山奈酚對缺氧/復氧損傷大鼠心肌細胞凋亡的影響 與對照組比較,缺氧/復氧組大鼠心肌細胞凋亡增加(P<0.05);與缺氧/復氧組比較,山奈酚組大鼠心肌細胞凋亡減少(P<0.05)。見圖1。

注:A為流式細胞儀檢測大鼠心肌細胞凋亡情況。B為各組凋亡情況統計圖;與對照組比較,*P<0.05;與缺氧/復氧組比較,#P<0.05

2.2 TUNEL檢測山奈酚對缺氧/復氧損傷大鼠心肌細胞凋亡的影響 與流式細胞檢測相似,與對照組比較,缺氧/復氧組大鼠心肌細胞凋亡增加;與缺氧/復氧組比較,山奈酚組大鼠心肌細胞凋亡減少。見圖2。

圖2 TUNEL染色檢測山奈酚對缺氧/復氧損傷大鼠心肌細胞凋亡的影響(×40)

2.3 山奈酚對缺氧/復氧損傷大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組比較,缺氧/復氧組大鼠心肌細胞CASP3和Bax蛋白表達增加,而Bcl-2表達減少(均P<0.05);與缺氧/復氧組比較,山奈酚組大鼠心肌細胞CASP3和Bax蛋白表達減少,而Bcl-2表達增加(均P<0.05)。見圖3。

注:A為凋亡相關蛋白表達灰度圖。B為凋亡相關蛋白相對含量統計圖;與對照組比較,*P<0.05;與缺氧/復氧組比較,#P<0.05

2.4 山奈酚對缺氧/復氧損傷大鼠心肌細胞鈣離子通道蛋白Cav1.2表達的影響 與對照組比較,缺氧/復氧組大鼠心肌細胞鈣離子通道蛋白Cav1.2表達增加(P<0.05);與缺氧/復氧組比較,山奈酚組大鼠心肌細胞Cav1.2表達減少(P<0.05)。見圖4。

注:A為鈣離子通道蛋白Cav1.2表達灰度圖。B為Cav1.2蛋白相對含量統計圖;與對照組比較,*P<0.05;缺氧/復氧組比較,#P<0.05

2.5 山奈酚對缺氧/復氧損傷大鼠心肌細胞[Ca2+]i的影響 與對照組比較,缺氧/復氧組大鼠心肌細胞[Ca2+]i增加;與缺氧/復氧組比較,山奈酚組大鼠心肌細胞[Ca2+]i減少。見圖5。

圖5 山奈酚對缺氧/復氧后大鼠心肌細胞[Ca2+]i的影響(Fluo-4M染色,×40)

3 討 論

在缺氧孵箱普及之前,心肌細胞缺氧/復氧損傷的細胞模型造模方法主要是在細胞培養時加入耗氧劑連二亞硫酸鈉,以此阻斷細胞的呼吸鏈,從而模擬細胞的缺氧狀態,但耗氧劑的細胞毒性作用強,且并不能完全模擬缺氧狀態。而通過細胞培養箱本身含氧量的調節不僅能夠模擬真實情況下的細胞缺氧/復氧狀態,還減少了其他因素對細胞生物學狀態的影響[9,13]。

凋亡的發生在心肌細胞缺氧/復氧損傷過程中發揮重要作用,控制心肌細胞凋亡可有效減少心肌細胞缺氧/復氧損傷及保護心肌細胞功能[14-15]。研究報道,山奈酚能夠通過抗凋亡發揮神經保護和骨保護作用[16-17]。本研究通過流式細胞儀、TUNEL染色和凋亡蛋白檢測等多種實驗方法從多個角度證實了,山奈酚能夠明顯減少缺氧/復氧損傷大鼠心肌細胞凋亡,這和之前研究結果一致。有學者報道,山奈酚可有效減少缺氧損傷、氧化應激損傷及炎癥刺激等多種不良條件誘導的心肌細胞凋亡[4-6]。但在胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤研究方面,山奈酚卻表現出了誘導凋亡的能力[18-21]。推測山奈酚對凋亡調控作用的不同可能主要因為細胞來源的異質性,對正常組織細胞山奈酚具有減少凋亡的作用,而對于腫瘤細胞其具有誘導凋亡的作用[22-25]。

心肌細胞缺氧/復氧損傷后凋亡的發生機制復雜,損傷后出現的鈣超載發揮關鍵作用[1,26-30]。心肌細胞內游離鈣離子的來源主要有外鈣內流和內鈣釋放,鈣超載的發生主要是由于外界刺激引起心肌細胞主要的鈣離子通道(電壓依賴型鈣離子通道)的開放,使得外鈣內流增加,進一步刺激細胞內的鈣庫釋放,導致[Ca2+]i升高,激活凋亡通路,誘導細胞凋亡的發生[31-34]。本研究發現,缺氧/復氧損傷刺激后心肌細胞上電壓依賴型鈣離子通道的核心蛋白Cav1.2表達升高,心肌[Ca2+]i也大幅升高,也證實了鈣超載在心肌細胞缺氧/復氧損傷后凋亡中的關鍵作用。而山奈酚干預后缺氧/復氧損傷誘導的鈣離子通道核心蛋白Cav1.2和[Ca2+]i增加都得到一定程度的抑制。本研究主要在體外驗證上述結論,后續實驗中我們將在體研究山奈酚對心肌IRI誘導凋亡的作用及機制。

綜上所述,山奈酚可能通過減少鈣離子通道蛋白Cav1.2表達和胞內鈣離子濃度抑制缺氧/復氧損傷誘導的大鼠心肌細胞H9C2凋亡。本研究不僅拓展了山奈酚在不同疾病模型上的應用,而且為開放新型治療心肌IRI藥物提供了一定的實驗基礎。