全反式維甲酸聯合小劑量阿糖胞苷對急性髓系白血病細胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶信號通路的作用機制研究

楊白梅,魯 猛,駱思君,王志華,伍華英,王 芳,趙耀順

(1.華北石油管理局總醫院普通內科,河北 任丘 062550;2.廊坊市中醫醫院,河北 廊坊 065800;3.華北石油二部醫院內科,河北 任丘 062552;4.華北石油中醫醫院內科,河北 任丘 062550;5.華北石油管理局總醫院血液內科,河北 任丘 062550)

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)為一類與血液系統造血干細胞有關的惡性克隆性疾病,以干細胞增殖異常,分化受阻、積聚,機體正常造血功能受到抑制為主,其發生發展與遺傳、生物等多種因素關系密切[1]。阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C)屬于嘧啶類抗代謝藥物,是治療AML的主要藥物之一[2]。臨床中給予高劑量Ara-C強化療法可使AML患者的總體生存率提高,復發率下降,但藥物的副作用也隨之增加[3]。全反式維甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)屬于一組維生素A的衍生物,為臨床中應用最為成功的分化誘導劑,對細胞增殖、分化、凋亡和胚胎發育中具有重要作用[4-5]。二者聯合用藥,可誘導幼稚細胞向成熟細胞分化并促進細胞凋亡,能降低臟器損害,抑制白血病細胞增殖,療效更佳,安全性較好[6]。AML發生和發展過程中磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol3-kinases,PI3K)/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶 (Protein-serine-threonine kinase,AKT)信號通路常被激活,被認為是AML治療的關鍵靶點之一[7-8]。基于此,本研究探討ATRA聯合小劑量Ara-C對AML細胞 HL-60增殖、凋亡的影響,并進一步分析其對PI3K/AKT信號通路的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人急性髓系白血病細胞HL-60(中科院上海細胞庫);阿糖胞苷、ATRA(美國Sigma公司);細胞培養液PRMI-1640、胎牛血清 FBS、青霉素、鏈霉素(美國Gibco公司);Trizol試劑(美國Invitrogen公司);MTT試劑盒、人膜聯蛋白 V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒(美國BD公司);反轉錄、BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司);鼠抗人 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT及鼠抗人GAPDH抗體(美國Abcam公司);FACScan流式細胞儀(美國 Beckman Coulte公司);實時熒光定量PCR儀、光學顯微鏡(日本 Olympus公司);Model 680 酶標儀、電泳儀(美國 Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和分組:將HL-60細胞培養于PRMI-1640培養液中(10%胎牛血清,100 U/ml鏈霉素和青霉素),培養條件:5%CO2、37 ℃,每2天對培養液進行依次更換,并進行傳代,取對數生長期細胞用于并制備細胞混懸液,進行分組:空白對照組(未經任何處理的HL-60細胞)、Ara-C組(加入0.5 μmol/L Ara-C)、ATRA組(加入2 μmol/L ATRA)、ATRA+Ara-C組(加入2 μmol/L ATRA和0.5 μmol/L Ara-C)。

1.2.2 CCK8檢測HL-60細胞活力:取經藥物處理后的各組細胞混懸液,對細胞密度做調整(3.0×103個/ml)并在96孔板(100 μl/孔)上接種,各組均設置5個平行復孔,分別培養24、48、72 h,并在每孔中加入10 μl CCK-8溶液,孵育2 h,酶標儀檢測450 nm波長的吸光度值,實驗獨立重復3次,計算細胞活力變化情況。細胞活力(%)=(A加藥組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.2.3 Annexin V雙染法檢測HL-60細胞凋亡:取經藥物處理后的各組細胞懸液,將1 ml細胞懸浮液1000 r/min離心5 min,PBS 洗滌細胞2次,加入200 μl的緩沖液重懸細胞,依據試劑盒說明依次加入2 μl的Annexin V和1.5 μl PI,于室內避光下孵育15 min,以流式細胞儀對各組細胞凋亡率進行測定。

1.2.4 細胞形態學觀察:取經藥物處理后的各組細胞混懸液1 ml,行1500 r/min離心5 min,棄上清,混勻細胞,涂片,自然干燥后,用Wright Giemsa染色,在光學顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.2.5 RT-qPCR檢測PI3K、AKT mRNA表達:取經藥物處理24 h后的各組細胞混懸液,用Trizol法提取總RNA,取2 μg RNA進行逆轉錄,引物序列:PI3K上游5’-CATCACTACGTGCTGCTCTAA-3’,下游5’-CAGTAGTTCCGATTGTTCATG-3’;PI3K上游5’-GCTGATGGCGCATGCTGACA-3’,下游5’-CGGTGCGTCAGCTCGATCAT-3’;內參GAPDH上游5’-GACCACTTTGTCAAGCTCTATTTCC-3’,下游5’-GTGAGGGTCTCTCTTCCTCTTGT-3’,逆轉錄后于常規反應條件下擴增,以40個循環為準,通過凝膠成像儀獲取圖像,2-ΔΔCt對樣本基因進行表達差異相對定量分析。

1.2.6 Western blot檢測PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達:取經藥物處理24 h后的各組細胞混懸液,提取總蛋白,蛋白上樣20 μg,經電泳分離移至PVDF膜上,選擇10%的山羊血清封閉2 h后,加入一抗4 ℃孵育過夜,再加二抗常溫孵育2 h,洗膜共3次,內參為GAPDH,運用化學發光液使其顯色,成像拍照后行灰度值統計分析。

2 結 果

2.1 CCK8檢測HL-60細胞活力 CCK8檢測結果顯示,空白對照組HL-60細胞活力高于Ara-C+ATRA組、Ara-C組、ATRA組,Ara-C組,ATRA組HL-60細胞活力高于Ara-C+ATRA組(均P<0.05)。

2.2 Annexin V雙染法檢測HL-60細胞凋亡 Annexin V雙染法檢測結果顯示,Ara-C+ATRA組HL-60細胞凋亡率高于Ara-C組、ATRA組,Ara-C組,ATRA組HL-60細胞凋亡率高于空白對照組(均P<0.05)。

2.3 各組細胞形態學觀察 HL-60細胞胞體多呈圓形,可見瘤狀突起,胞核多為類圓形。Ara-C組、ATRA組染色質凝聚,顏色變深,部分胞核變小,Ara-C+ATRA組染色質凝聚,顏色變深,可見核固縮、核碎裂。見圖1。

圖1 各組細胞形態學觀察 (Wright Giemsa染色,×200)

2.4 qRT-PCR檢測PI3K、AKT mRNA表達 qRT-PCR檢測結果顯示,空白對照組HL-60細胞PI3K、AKT mRNA表達高于Ara-C組、ATRA組,Ara-C組,ATRA組HL-60細胞PI3K、AKT mRNA表達高于Ara-C+ATRA組(均P<0.05)。

2.5 Western blot檢測PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達 Western blot檢測結果顯示,空白對照組HL-60細胞P-PI3K、P-AKT 蛋白表達高于Ara-C組、ATRA組,Ara-C組、ATRA組HL-60細胞P-PI3K、P-AKT蛋白表達高于Ara-C+ATRA組(均P<0.05)。

3 討 論

AML是一種常見血液系統惡性腫瘤,經治療約80%患者病情有所改善,但多數整體預后不佳,5年總生存率在40%～50%[9-10]。Ara-C是一種嘧啶類抗代謝藥物,進入人體后會轉化成Ara-C三磷酸,通過抑制細胞DNA的合成,干擾細胞的增殖[11]。ATRA被認為是第一個腫瘤治療的靶向藥物,能與維甲酸受體,如維甲酸受體alpha(RARtα)等產生協同作用,抑制細胞周期蛋白依賴性激酶活化激酶(CAK)磷酸化RARα,誘導翻譯后修飾RARα去磷酸化,使白血病細胞分化或凋亡[12-13]。ATRA聯合低劑量Ara-C能發揮與強化療法相同或者更好效果,可使化療藥物帶來的臟器損害降低,優化治療方案。肖蓉等[14]選擇85例AML患者予以ATRA與小劑量阿糖胞苷聯用治療,證實小劑量Ara-C+ATRA治療AML降低化療風險,減少骨髓抑制毒性,早期病死率低于單獨用藥組。本研究發現,Ara-C+ATRA組HL-60細胞低于Ara-C組、ATRA組、空白對照組,Ara-C+ATRA組HL-60細胞凋亡率Ara-C組、ATRA組、空白對照組。HL-60細胞胞體多呈圓形、可見瘤狀突起、胞核多為類圓形,Ara-C組、ATRA組染色質凝聚,顏色變深,部分胞核變小,Ara-C+ATRA組染色質凝聚,顏色變深,可見核固縮、核碎裂。這表明Ara-C+ATRA聯合用藥可明顯抑制HL-60細胞的增殖,促其凋亡,細胞形態上也明顯出現分化的特征。林曉媛等[15]發現,阿糖胞苷能通過上調miR-126抑制HL-60增殖及促進細胞凋亡。彭煜暉等[16]報道了,Ara-C能夠誘導HL-60細胞凋亡,并伴c-Myc、B淋巴細胞瘤-2(BCL-2)基因的下調,并探索Ara-C誘導AML MV4-11細胞凋亡的分子機制,發現Ara-C能下調HMGB1/c-Myc的表達來抑制人AML細胞活力和誘導細胞凋亡。

PI3K-AKT是包括AML在內的癌癥異常上調的細胞內通路之一,在AML中,PI3K-AKT通路對于疾病的發生和化療敏感性非常重要,其過度激活與AML細胞的耐藥和復發關系密切[17-19]。為了進一步探討Ara-C+ATRA對HL-60細胞增殖及凋亡的作用機制,本研究選擇Western blot法和qRT-PCR法測定PI3K/AKT信號通路相關蛋白和mRNA水平,結果表明,Ara-C+ATRA組HL-60細胞PI3K、AKT-mRNA及P-PI3K、P-AKT蛋白表達高于空白對照組、Ara-C組、ATRA組,分析原因可能與AML細胞系HL-60中PTEN基因有2～5外顯子的缺失有關,PTEN是PI3K/AKT通路重要的負調控因子,可水解磷酸肌醇的3位磷酸,達到下調PI3K/AKT通路的信號轉導功能的作用,PTEN基因突變引起了PTEN功能缺失,故PI3K、AKT蛋白磷酸化水平升高[20-22]。徐偉等[23]研究發現,FN-α、ATRA均能抑制PI3K /AKT信號通路激活,p-AKT蛋白表達降低后,對促凋亡蛋白Bad的抑制作用下降,總Bad蛋白升高,Bad蛋白通過與抗凋亡因子Bcl-2或Bcl-xL結合形成促凋亡復合體,引起一系列反應促進K562/ADM細胞凋亡。高莉等[24]證實了,AML細胞株K562和HL-60耐藥株中通過siRNA敲低lncRNA CBR3-AS能降低改善AML Ara-C耐藥,降低PI3K、AKT蛋白的磷酸化水平。但由于本研究為體外實驗研究,后期還需進一步做動物體內實驗分析Ara-C、ATRA殺傷白血病細胞的內在機制,為白血病治療提供證據[25]。

綜上所述,Ara-C、ATRA單獨和聯合應用均能通過抑制PI3K/AKT信號通路激活,促進HL-60細胞凋亡。