絲裂原活化蛋白激酶4、生存素基因在喉鱗狀細胞癌組織中的表達及其意義

單鳳金,張 義,許堯生

(衡水市人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科,河北 衡水 053000)

喉癌是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤之一,多發于50～70歲男性,以鱗狀細胞癌最為常見,喉癌好發年齡為40～60歲,男性多于女性,喉癌病因迄今尚未完全闡明,除外源性因素(吸煙、飲酒、病毒感染和空氣污染等)外,也與內源性因素(如:促癌基因激活、抑癌基因失活和凋亡相關基因異常表達等)關系密切[1-2]。絲裂原活化蛋白激酶4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4,MKK4)是MAPK的激酶,也是癌基因Ras信號傳導通路的中心環節,經亞細胞定位研究發現,MKK4蛋白主要定位于細胞質,細胞核中也有MKK4蛋白表達[3-4]。生存素(Survivin)是由細胞內質網絡激活后所生成的一種抗凋亡蛋白,參與調節細胞有絲分裂過程,其過度表達可加速細胞周期的S期轉換,啟動有絲分裂及細胞周期[5]。研究發現,膀胱癌、胃癌、食管鱗狀細胞癌等腫瘤中Survivin出現過度表達,MKK4與多種惡性腫瘤關系密切,包括:鼻咽癌等[6-7]。基于此,本研究觀察MKK4、Survivin基因在喉鱗狀細胞癌組織中的表達,探討其在喉癌發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2015年1月至2017年5月收治的82例喉癌患者,病例納入標準:首次手術;術后經病理診斷為喉鱗狀細胞癌;術前未接受放化療;臨床病理資料完整;本試驗內容患者與家屬均知情,并已簽署知情同意書。排除標準:伴有心、肝、腎、肺等疾病;凝血功能障礙;合并其他自身免疫疾病、精神疾病及惡性腫瘤。82例患者中男62例,女20例,年齡35～82歲,平均(62.94±8.32)歲;TNM分期:Ⅰ期23例,Ⅱ期30例,Ⅲ期21例,Ⅳ期8例;分化程度:高分化25例,中分化36例,低分化21例。收集82例喉癌患者腫瘤組織、癌旁組織(距癌組織>0.5 cm)的石蠟標本待測。

1.2 主要試劑和儀器 總RNA提取、Trizol試劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海聯邁生物工程有限公司,貨號:LM3201-1、LM-21087R、LM0012S);反轉錄試劑盒(雅吉生物,貨號:D1801XL);DAB顯色試劑盒(上海源葉生物科技有限公司,貨號:R21317);實時熒光定量PCR儀、光學顯微鏡(日本 Olympus公司);Model 680 酶標儀、電泳儀(美國 Bio-Rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 RT-PCR檢測組織中MKK4、Survivin mRNA表達:取腫瘤組織、癌旁組織,研磨破碎,總RNA以Trizol法提取,并取2 μg RNA行逆轉錄后并擴增,引物序列:MKK4上游5’-CGGGTTCTTCTCTGGTCCTTG-3’,下游5’-CTGACAGTGGTGCAGTTCCA-3’;Survivin上游5’-TCGGCTCTTCACTCCCAACA-3’,下游5’-TCAACTTCAGTGCTTTGCGTT-3’;內參GAPDH上游5’-GACCACTTTGTCAAGCTCTATTTCC-3’,下游5’-GTGAGGGTCTCTCTTCCTCTTGT-3’,擴增于常規條件下展開,經40個循環后,利用凝膠成像儀獲取圖片,2-ΔΔCt對樣本基因進行表達差異相對定量分析。

1.3.2 免疫組化檢測組織中MKK4、Survivin蛋白表達:取腫瘤組織和癌旁組織,經脫蠟、脫苯、水化和抗原修復后,用3% H2O2去除內源性過氧化物酶,清洗并封閉10 min,分次加入MKK4單克隆抗體、Survivin抗體,4 ℃過夜,以PBS洗滌2 min,共3次,加入二抗,37 ℃ 20 min,以PBS洗滌2 min,共3次,加試劑SABC,37 ℃ 20 min,以PBS洗滌5 min,共4次,加入DAB顯色劑,蘇木精-復染、脫水干燥后封片,以PBS為陰性對照,于顯微鏡下觀察。

1.4 結果判定 MKK4、Survivin陽性表現為淡黃色至棕褐色顆粒,光鏡下隨機以5個高倍視野觀察陽性細胞數和細胞總數。按染色強度分0～3分,無色、淡黃色、棕黃色和棕褐色。按陽性染色細胞百分率分為1～3分,1分為11%～50%,2分為51%～75%,3分為>75%,>3分為陽性(+),≤3為陰性(-)。

1.5 隨 訪 隨訪5年,以復診、電話等方式記錄患者生存情況。

2 結 果

2.1 喉癌組織和癌旁組織MKK4、Survivin mRNA表達比較 喉癌組織MKK4 mRNA表達較癌旁組織降低,Survivin mRNA表達較癌旁組織增加(均P<0.05),見表1。

表1 喉癌組織和癌旁組織MKK4、Survivin mRNA表達比較

2.2 喉癌組織和癌旁組織MKK4、Survivin蛋白表達比較 MKK4、Survivin蛋白主要定位于細胞質,少部分位于細胞核中呈棕黃色;癌旁組織和喉癌組織MKK4 蛋白陽性表達率分別為71.95%(59/82)和40.24%(33/82),Survivin 蛋白陽性表達率分別為23.17%(19/82)和71.95%(59/82)(χ2= 16.737,χ2=39.117,均P<0.01)。見圖1。

圖1 喉癌組織和癌旁組織MKK4、Survivin蛋白表達(免疫組化染色,×400)

2.3 MKK4、Survivin蛋白陽性表達與臨床病理參數的關系 不同性別、年齡患者喉癌組織MKK4、Survivin蛋白陽性表達比較,無統計學差異(均P>0.05);在不同TNM分期、腫瘤分化程度和有無淋巴結轉移患者中比較,差異有統計學差異(均P<0.05)。見表2。

表2 MKK4、Survivin蛋白陽性表達與臨床病理參數的關系[例(%)]

2.4 MKK4、Survivin表達的相關性 Spearman相關性分析顯示,喉癌組織中MKK4與Survivin表達為負相關(r=-0.403,P<0.05)。

2.5 隨訪5年生存率 隨訪結果,MKK4陽性患者5年生存率81.82%(27/33)高于陰性患者65.31%(32/49),Survivin陽性患者5年生存率62.71%(37/59)較陰性患者82.61%(19/23)下降(χ2=7.419,χ2=11.060,均P<0.05),見圖2。

圖2 MKK4、Survivin(+)和(-)表達患者的生存曲線

2.6 喉癌患者預后因素Cox回歸模型分析 Cox回歸模型分析顯示,影響喉癌患者預后的因素為TNM分期和MKK4、Survivin(均P<0.05),見表3。

3 討 論

喉癌是耳鼻喉部最為常見的惡性腫瘤,其發病率占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%,近幾年,發病率及病死率均有所增長,可能與喉癌早期無明顯癥狀,診斷比率較低有關,延誤了患者的最佳治療時機[8-9]。且當晚期患者行全喉切除術后,發聲功能會受到永久影響,臨床中治療中要對喉腔發聲、呼吸等盡可能保留,以提高患者生活質量,為此諸多研究人員逐漸開展,如:生物學療法、基因療法等新式喉癌療法[10-11]。Survivin基因位于染色體17q25,其分子含有桿狀病毒凋亡抑制蛋白(IAP)重復序列(BIR)和α螺旋分子結構,前者含有促癌細胞凋亡的氨基酸,可作用于Caspase 路徑,對其正常功能造成干擾,而α螺旋結構能在有絲分裂早期同組成紡錘體的微管結合,這能使癌細胞進入有絲分裂期,加快腫瘤的惡性程度和侵襲性[12-16]。MKK4基因定位于人染色17p11.2,為MAPK信號傳導通路的重要組成部分,能磷酸化并激活其通路分支,在將細胞外信號傳導至細胞及核內后,引起細胞生物學反應,包括:增殖、分化及凋亡等[17-18]。

本研究中,喉癌組織中Survivin mRNA表達高于癌旁組織,喉癌組織Survivin 蛋白陽性表達率為71.95%高于癌旁組織,喉癌組織中MKK4 mRNA表達低于癌旁組織,喉癌組織MKK4 蛋白陽性表達率為40.24%,癌旁組織MKK4 蛋白陽性表達率高達71.95%,并且和腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關。并推測MKK4蛋白表達下調可能是喉癌發生的啟動因素之一,Survivin高表達是腫瘤惡性表型的標志。Survivin表達水平增加后,對細胞凋亡產生抑制,使有絲分裂啟動,組織出現增生,組織的分化、腫瘤生長的速度和轉移能力增強[19-24]。而MKK4在人類多種類型的腫瘤中出現過缺失或突變,突變率約為5%,當外界環境或細胞內信號對細胞產生刺激后,這類基因將引起JNK或p38通路的活化,造成腫瘤細胞內微環境的改變,使MKK4蛋白表達異常[25-28]。楊光等[29]也證實,癌旁組織Survivin陽性表達率低于喉癌組織,Ⅲ-Ⅳ期的患者表達率較Ⅰ-Ⅱ期高,淋巴結轉移者較無淋巴結轉移者升高。楊花榮等[30]通過免疫組化技術檢測發現,Ⅲ-Ⅳ期、淋巴結轉移患者MKK4蛋白陽性表達率分別為57.14%和61.22%,較Ⅰ-Ⅱ期、無淋巴結轉移患者明顯下降。張慧等[31]證實了,MKK4基因在結直腸癌組織中的表達顯著下降。以上研究證明了MKK4與鼻咽癌的負相關性。此外,隨訪5年,MKK4陽性患者5年生存率81.82%(27/33)高于陰性患者65.31%(32/49),Survivin陽性患者5年生存率62.71%(37/59)低于陰性患者82.61%(19/23)。Cox回歸模型分析,影響喉癌患者預后的因素為TNM分期和MKK4、Survivin。這也說明Survivin高表達與患者預后不良密切相關,MKK4低表達與患者預后不良密切相關。

綜上所述,喉癌組織中MKK4表達下調,Survivin表達上調,兩者可能是潛在的預后標記物以及治療靶點。深入研究 Survivin和MKK4在喉癌中的作用機制,將對喉癌的治療提供新思路。