毛果楊RAV 基因家族生物信息學與組織表達分析

范文欣 劉秋艷 陳 甜 王一淇 王海凌 王曉立

（宿遷學院建筑工程學院園林教研室，江蘇 宿遷 223800）

毛果楊（Populus trichocarpa）為楊柳科半常綠喬木，具有易繁殖、生長迅速等特點，是木本植物研究的模式生物。轉錄因子是一類能夠與DNA 序列特異性結合[1]，調節基因轉錄本表達的蛋白質。轉錄因子在植物的生長發育、代謝反應和抗逆反應等多種過程中發揮重要作用[2]。RAV 屬于AP2/ERF轉錄因子家族的一個亞家族，僅在植物中存在，對植物的多個生物學過程有重要意義。RAV 蛋白同時含有B3 保守域和AP2 保守域[3]，其中B3 保守域能特異地與靶序列CACCTG 結合，處于蛋白C 端；處于蛋白N 端的AP2 結構域則與GCC 盒結合密切相關。相關學者已在多個植物中對RAV 家族進行了全基因組分析：荔枝[4]（Litchi chinensis）和杧果[5]（Mangifera indica）中鑒定得到4 個RAV 轉錄因子；新疆沙冬青[6]（Ammopiptanthus mongolicus）、鉆天柳[7]（Chosenia arbutifolia）、二倍體棉花[8]（Gossypium australe）和龍眼[9]（Dimocarpus longan）中的RAV 成員數量分別是2、4、10和4個；在擬南芥中[10]鑒定有13個RAV基因，其中有6個具有AP2結構域，其他則只具有B3 結構域。可見不同物種之間RAV 基因家族數量和具有AP2結構域的基因數量有一定的變化。

RAV 轉錄因子不僅參與植物一系列的生長發育過程，還參與植物對外界的脅迫反應，同時還在抗病性中發揮重要作用。RAV 同源蛋白在植物中是一個龐大的蛋白家族，其調節生物學功能的分子機制和功能多樣性還需進一步研究和證明。RAV 同源蛋白在毛果楊植物中研究尚不多見。目前，有關毛果楊RAV 家族的相關報道較少。本研究對毛果楊RAV 同源蛋白進行鑒定，分析蛋白結構特征，為RAV 同源蛋白功能的解析、植物的生長發育及抗逆研究提供理論基礎，同時也為后期分子輔助育種和生物技術工具提供依據，從而培育出達到經濟目的的優良品種。

1 材料與方法

1.1 數據獲取

通過Phytozome數據庫（https∶//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）檢索“RAV”，查找并獲得毛果楊RAV基因序列。

1.2 分析方法

1.2.1 RAV 蛋白基因的搜索與確認RAV蛋白的同源序列在毛果楊基因組中作為候選蛋白，然后對所有候選基因的候選蛋白結構域進行在線分析預測位點上的PFAM 和SMART 蛋白結構域分析。得到的基因是毛果楊的RAV 基因家族的全部成員。

1.2.2 毛果楊RAV 基因家族結構分析毛果楊基因家族成員結構分析：基因名稱，基因序列大小，編碼序列大小等信息。

1.2.3 毛果楊RAV 基因家族理化性質分析和亞細胞定位利用Expasy 的ProtParam 軟件（HTTPS：/Web.Expasy.org/ProtParam/)分析RAV 基因家族成員的物理和化學特性。毛果楊RAV 基因家族成員的亞細胞定位是通過在線軟件Plant-MPloc 進行預測的。

1.2.4 motif 結構對比和系統發育樹構建通過MEME Suite 5.5.1（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）進行基序結構分析，使用MEGA 7.0軟件為毛果楊、甜橙、番茄、擬南芥和黃瓜等的RAV基因家族成員構建系統發育樹。

1.2.5 毛果楊RAV 基因家族器官組織的基因表達在Affymetrix 網站上搜索RAV 基因家族成員的探針，并通過BAR 數據庫（bar.Utoronto）檢索成員的組織表達的相對量。運用聚類熱圖軟件Multiple Experiment Viewer 繪制RAV 基因家族組織表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 毛果楊RAV家族的鑒定

在Phytozome中以“RAV”為關鍵詞進行檢索，選取6個毛果楊基因序列，6個基因的蛋白氨基酸數長度在369～2 556，Potri.002G173300.1 蛋白質氨基酸數比較大，在2556。在Expasy（Expasy ProtParam tool）數據庫中可以看出，Potri.002G173300.1 蛋白質為酸性蛋白，理論等電點為6.2；其余成員均為堿性蛋白（理論等電點均大于7）。6 個基因的蛋白相對分子量在42 725.38～281 004.09，Da，Potri.002G1733 00.1 蛋白質相對分子量最大。6 個基因的蛋白不穩定系數在42.76～78.05。毛果楊RAV 基因平均親水系數在-0.378 與-0.723，Potri.002G173300.1 蛋白質親水系數較大在-0.073，均為親水性蛋白。毛果楊RAV 基因編碼的蛋白質主要定位于細胞核和細胞質中，只有Potri.002G173300.1的蛋白質定位預測在葉綠體或細胞核中出現。毛果楊RAV 基因家族的理化性質和亞細胞定位如表1所示。

表1 毛果楊RAV基因家族的理化性質和亞細胞定位

2.2 毛果楊RAV氨基酸序列比對在線分析

利用MEGA5軟件，對6個毛果楊的氨基酸序列進行在線分析（圖1）。標星號序列標注的同源性更高，呈現高度保守的特征。

圖1 毛果楊RAV基因家族氨基酸序列比對

2.3 毛果楊RAV系統發育樹分析

為更好地了解毛果楊RAV基因家族的系統發育關系，將毛果楊（6個），甜橙（orange1.1 g 046898m、orange1.1g018549m、orange1.1g017035m），番茄（Solyc05 g 009790.1、Solyc03g083110.1、Solyc04g007000.2），擬南芥（AT1G50680、AT1G51120、AT1G25560），黃瓜（Cucsa.142990、Cucsa.147340）RAV基因編碼的蛋白質序列通過MEGA7 軟件進行蛋白質氨基酸序列分析，并構建6 個毛果楊與其他物種植物RAV 蛋白系統進化樹（圖2），將RAV 基因家族分成4 個相對獨立的亞族。亞族III 僅含一個番茄成員Solcy03g083110.1；亞族IV 僅含一個毛果楊成員Potri.002G173300；這兩個亞族可能是在番茄、毛果楊中獨自進化的結果，也可能是其他相關物種中發生了基因丟失現象。亞族I中基因數目最多，含8個基因，來自毛果楊、甜橙、擬南芥和黃瓜4 個物種，Potri.006G186301.1 與Potri.018G109201.1 在同一分支點上，與Potri.003G212800.1有一定差異性；亞族II中包含7個基因，由來自毛果楊、甜橙、番茄、擬南芥和黃瓜5 個物種的RAV 成員構成，Potri.010G12920 0.1與Potri.008G117100.1在同一分支點上。

圖2 RAV基因家族系統發育樹

2.4 毛果楊RAV motif分析

選用6 個毛果楊RAV 基因家族成員，發現毛果楊RAV 基因的序列長度差異不大。從毛果楊RAV家族蛋白motif 分析可以看出（圖3），Potri.002G173300 基因較其他RAV 家族蛋白的氨基酸數量差距都比較大，且只有1個相同的蛋白質基序，這也同RAV基因家族系統發育樹中Potri. 002G173300基因單獨被列為一支一致。其余RAV 基因家族蛋白與擬南芥AT1G25560、AT1G50680 具有類似的motif 結構，總體上看PtRAV 具有比較保守的基因序列。

2.5 毛果楊RAV基因家族表達分析

選用5個毛果楊RAV基因家族成員（Potri.003G 212800.1未查詢到相應探針），通過BAR數據庫檢索RAV基因家族成員組織表達的相對量（圖4）。所選用的5個不同的毛果楊RAV基因家族成員在發育過程中的表達存在明顯的差異，其在根、莖、幼葉、成熟葉、雄蕊、雌蕊和頂芽中均有表達，毛果楊RAV基因在頂芽中整體表達量較高，Potri.008G117100最高達132.18，在根、莖與幼葉中基因表達量次之，在雄蕊和成熟葉中基因表達量較少，雌蕊中基因表達量最低，Potri.006G186301 基因在雌蕊中不表達，這說明該基因同源蛋白為不穩定蛋白。除此之外，在5 個家族成員序列中，Potri.008G117100和Potri.010G129 200基因表達相近，Potri.002G173300和Potri.008G11 7100、Potri.010G129200 基因表達有一定差異性，Potri.018G109201 差異性最大，Potri.018G109201 主要在葉片中表達量最高。因此，可推測，毛果楊RAV 家族蛋白不僅具有多樣性，與親緣關系較近的蛋白還具有相似或相近的基因表達。

圖4 毛果楊RAV基因家族組織表達

3 結論與討論

RAV 是AP2/ERF 轉錄因子亞家族成員，在生物與非生物脅迫中發揮重要作用，但對其在楊樹中的功能探討較為有限[11]。RAV基因不僅參與植物的一系列生長發育過程，并且還參與植物對外界的脅迫反應，在抗病方面也發揮著重要作用。RAV 家族是AP2/ERF 轉錄因子家族中一個重要的亞家族，僅存在于植物中，對植物的多個生物學過程都具有重要意義[12]。RAV轉錄因子不僅參與植物一系列的生長發育過程，還參與植物對外界的脅迫反應，同時還在抗病性中發揮重要作用。水稻OsRAV11 和Os-RAV12 可能對水稻種子的大小和心皮分化過程起調控作用[13]。Cao 等[6]在煙草上的研究發現，NtRAV-4 被沉默后，種子萌芽和根系發育的速度變快，且葉片光合能力增強；下調NtRAV-4 后煙草植株的抗旱性增強。

經分析，毛果楊中一共獲得6 個PtRAV 基因。PtRAV 蛋白序列長度和分子質量相對穩定，而等電點等性質差異較大，這與相關學者對煙草的研究結果相似[14]。亞細胞定位分析發現，PtRAV 均定位于細胞核與細胞質中，這與其他植物中如杧果和苦蕎等的結果相似[6,15]，推測PtRAV主要在細胞核與細胞質中發揮作用。通過對擬南芥、番茄、甜橙等RAV蛋白進行系統進化、保守結構域和保守基序分析發現，LcRAV聚集在第I、II和IV 3個亞族。同一亞族蛋白的保守結構域的位置、保守基序的種類和位置趨向一致，并且不同植物RAV之間至少存在5個共同的保守基序，分別是motif 1、motif 3和motif 2（5′→3′），同時motif 1 和motif 2/3 可能分別是AP2 結構域和B3結構域的主要組成部分，這與Ji 等[16]的研究結果一致，也說明了RAV家族具有較高的保守性。毛果楊RAV 家族蛋白不僅具有多樣性，對于親緣關系較近的蛋白，它們還具有相似或相近的生物學功能和理化性質。

本研究基于毛果楊全基因組分析，鑒定出6 個RAV基因家族成員，系統分析了毛果楊RAV同源蛋白的基本結構信息、進化關系、理化性質、亞細胞定位和組織表達分析等信息，為克隆毛果楊RAV同源蛋白提供信息，并為RAV 同源蛋白功能的解析、調控網絡的構建以及為植物的生長發育及抗逆中的作用研究提供一定的參考。對于亞細胞定位等相關預測結果仍需要試驗驗證，涉及的代謝通路等將是后續研究的主要內容。