FOXM1 和PUM1 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

沈家生 黃海斌 吳康中

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，居全球腫瘤相關(guān)死亡原因第3 位[1]。盡管結(jié)腸癌的治療已取得了進(jìn)展，但由于腫瘤易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率仍較低[2]。因此，早期診斷和準(zhǔn)確預(yù)測(cè)預(yù)后對(duì)結(jié)腸癌患者的治療至關(guān)重要。叉頭盒蛋白M1（FOXM1）是叉頭蛋白家族成員，在細(xì)胞周期中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明FOXM1 蛋白過(guò)表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生和不良預(yù)后有關(guān)，被認(rèn)為是一種“原致癌”轉(zhuǎn)錄因子和腫瘤標(biāo)志物[3-4]。哺乳動(dòng)物Pumilio（PUM）蛋白是序列特異性的RNA 結(jié)合蛋白（RBP），具有廣泛的作用，其參與了生殖細(xì)胞發(fā)育[5]。研究發(fā)現(xiàn)FOXM1 可作為PUM1 的潛在轉(zhuǎn)錄激活因子，參與了睪丸癌進(jìn)展[6]。目前FOXM1、PUM1 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及作用機(jī)制尚未明確，本研究探討了結(jié)腸癌組織中FOXM1、PUM1的表達(dá)水平及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以期為結(jié)腸癌患者的早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)提供參考依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2017年1月至2019年6月在湖州市第一人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的135 例結(jié)腸癌患者作為研究對(duì)象，收集患者的結(jié)腸癌組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者的診斷符合結(jié)腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，并且經(jīng)病理檢查確診；（2）首次診斷為結(jié)腸癌；（3）手術(shù)前未接受放射治療和化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并心血管、腎臟、肝臟疾病；（2）合并嚴(yán)重糖尿病、慢性肺部疾病；（3）有免疫功能、凝血功能障礙；（4）合并其他惡性腫瘤。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)1611251906），所有受試者及其家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑與儀器

兔抗人PUM1 多克隆抗體（貨號(hào)ab265285）、兔抗人FOXM1 多克隆抗體（貨號(hào)ab180710），均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；DAB 顯色試劑盒（貨號(hào)GK347010），購(gòu)自基因科技（上海）股份有限公司；RIPA 裂解液，購(gòu)自上海躍騰生物技術(shù)有限公司；Tanon 5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)組織中FOXM1、PUM1 的表達(dá)情況 組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片（4 μm 厚）、脫蠟、水合后，加入3% H2O2孵育以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。將組織切片分別與兔抗人PUM1、兔抗人FOXM1 多克隆抗體在4 ℃下（稀釋比例為1 ∶300）孵育過(guò)夜，然后滴加二抗在室溫下孵育10 min，用PBS 洗滌3 次。將組織切片加入3,3'-二氨基聯(lián)苯胺溶液在室溫下孵育10 min，然后用蘇木精復(fù)染，用樹(shù)脂覆蓋。

由2 名病理科醫(yī)師（副主任醫(yī)師及以上職稱）評(píng)估染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞比例。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：未染色記為0 分；弱染色（+）記為1 分；中度染色（++）記為2 分；強(qiáng)染色（+++）記為3 分。染色細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0%記為0 分；1%～25%記為1 分；26%～50%記為2 分；51%～75% 記為3 分；76%～100% 記為4 分。 將染色強(qiáng)度評(píng)分與染色細(xì)胞比例評(píng)分相乘得到總評(píng)分（0～12 分）：0～4 分為陰性表達(dá)；5～12 分為陽(yáng)性表達(dá)。陽(yáng)性表達(dá)率＝陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)組織中FOXM1、PUM1蛋白表達(dá)水平 采用RIPA 裂解液從組織中提取總蛋白。將30 μg 蛋白質(zhì)樣品用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將膜在室溫下用5% BSA 液封閉2 h，然后加入一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。采用TBST 緩沖液對(duì)膜進(jìn)行2 次洗脫，將膜加入二抗在37 ℃下孵育2 h。使用ECL 發(fā)光液和Tanon 5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，分別以GAPDH、β-actin 為內(nèi)參，采用目的蛋白與內(nèi)參灰度值之比評(píng)估FOXM1、PUM1 蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.3 隨訪

患者出院后，采用門診復(fù)查或電話詢問(wèn)的方式進(jìn)行隨訪，第1、2年每3 個(gè)月隨訪1 次，第3年起每6 個(gè)月隨訪1 次，記錄患者的生存時(shí)間。隨訪截至2022年6月或以患者死亡為隨訪終點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，2 組間比較采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)性分析探討組織中PUM1 與FOXM1 表達(dá)的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線分析結(jié)腸癌組織中FOXM1、PUM1 表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系；采用多因素Cox回歸分析探討結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織與癌旁組織中FOXM1 和PUM1 的表達(dá)情況比較

結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中FOXM1 陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織[ 74.07%（100/135）比16.30%（22/135）]，PUM1 陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織[ 82.22%（111/135）比13.33%（18/135）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)圖1、表1。

表1 結(jié)腸癌組織與癌旁組織中FOXM1 和PUM1 的表達(dá)情況比較/例（%）

圖1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中FOXM1 和PUM1 的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)染色 ×200 A 結(jié)腸癌組織中FOXM1 表達(dá) B 癌旁組織中FOXM1 表達(dá) C 結(jié)腸癌組織中PUM1 表達(dá) D 癌旁組織中PUM1 表達(dá)

2.2 結(jié)腸癌組織與癌旁組織中FOXM1 和PUM1 蛋白表達(dá)水平比較

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中FOXM1、PUM1 的表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)圖2、圖3和表2。

表2 結(jié)腸癌組織與癌旁組織中PUM1 和FOXM1 蛋白表達(dá)水平比較

圖2 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中FOXM1 蛋白表達(dá)水平

圖3 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中PUM1 蛋白表達(dá)水平

2.3 結(jié)腸癌組織中PUM1 與FOXM1 表達(dá)的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中PUM1 與FOXM1 表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.514，P＜0.05）。

2.4 PUM1 和FOXM1 表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中PUM1 和FOXM1 表達(dá)水平與年齡、性別、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度均不相關(guān)（P均＞0.05），而與有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤分化程度、有無(wú)脈管癌栓均有相關(guān)性（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 結(jié)腸癌組織中PUM1 和FOXM1 表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.5 Kaplan-Meier 生存曲線分析

本研究對(duì)患者隨訪3年，有49 例患者死亡，有86 例患者生存，無(wú)失訪病例，3年總生存率為63.70%。繪制3年Kaplan-Meier 生存曲線，分析結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中FOXM1 陽(yáng)性表達(dá)患者的3年累積生存率顯著低于FOXM1 陰性表達(dá)患者[60.36%（67/111）比79.17%（19/24）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（log-rankχ2＝6.216，P＝0.013）；結(jié)腸癌組織中PUM1 陽(yáng)性表達(dá)患者的3年累積生存率顯著低于PUM1 陰性表達(dá)患者[58.00%（58/100）比80.00%（28/35）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（log-rankχ2＝6.688，P＝0.010）。見(jiàn)圖4。

圖4 Kaplan-Meier 生存曲線分析 A FOXM1 陽(yáng)性和陰性表達(dá)患者的生存曲線 B PUM1 陽(yáng)性和陰性表達(dá)患者的生存曲線

2.6 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1、PUM1、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期及分化程度均與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良均有相關(guān)性（P均＜0.05）。多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1、PUM1、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期及分化程度均是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析

3 討論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，全球每年約有120 萬(wàn)例新發(fā)病例和60 萬(wàn)例死亡病例[8-9]。盡管目前結(jié)腸癌的診斷和治療方面已有了進(jìn)步，但患者的生存率仍無(wú)顯著提高[10]。因此，尋找新的結(jié)腸癌診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的特異性生物標(biāo)志物具有重要意義。

PUM 蛋白在機(jī)體中調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)[11]。研究表明PUM1 在多種腫瘤中呈高表達(dá)，已知其表達(dá)上調(diào)與前列腺癌患者生存率降低相關(guān)[12]。Yang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)PUM1 基因表達(dá)下調(diào)可抑制胰腺導(dǎo)管腺癌進(jìn)展，低水平的PUM1 mRNA 提示患者的預(yù)后良好。Gor 等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)結(jié)腸癌細(xì)胞系相比，原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞系中PUM1 mRNA 的表達(dá)水平均顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中PUM1 的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織（82.22%比13.33%，P＜0.05），結(jié)腸癌組織中PUM1表達(dá)水平也顯著高于癌旁組織（P均＜0.05），這提示PUM1 在結(jié)腸組織中發(fā)揮了致癌作用。本研究還分析了結(jié)腸癌組織中PUM1 表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示其與有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度及有無(wú)脈管癌栓均有相關(guān)性，提示結(jié)腸癌組織中PUM1 表達(dá)水平可反映腫瘤進(jìn)展程度，其過(guò)表達(dá)可能會(huì)增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中PUM1 陽(yáng)性表達(dá)患者的3年累積生存率顯著低于PUM1 陰性表達(dá)患者（58.00%比80.00%，log-rankχ2＝6.688，P＝0.010），這提示PUM1 有潛力作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

FOXM1 是一種轉(zhuǎn)錄因子，是多條促癌信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活G2/M 特異性基因網(wǎng)絡(luò)，在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)FOXM1 在多種惡性腫瘤（如乳腺癌[17]、卵巢癌[18]、肺癌[19]及結(jié)腸癌[20]）中表達(dá)上調(diào)，其與腫瘤惡性程度高、耐藥及患者預(yù)后不良有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中FOXM1 的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織（74.07%比16.30%，P＜0.05），結(jié)腸癌組織中FOXM1 表達(dá)水平也顯著高于癌旁組織（P＜0.05），其作用機(jī)制可能是FOXM1通過(guò)激活Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，從而參與結(jié)腸癌的發(fā)生和進(jìn)展。本研究還分析了結(jié)腸癌組織中FOXM1 表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示其與有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度及有無(wú)脈管癌栓均有相關(guān)性，這提示FOXM1 高表達(dá)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，推測(cè)FOXM1 有潛力作為結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)。Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中FOXM1 陽(yáng)性表達(dá)患者的3年累積生存率顯著低于陰性表達(dá)患者（60.36%比79.17%，log-rankχ2＝6.216，P＝0.013），這提示FOXM1 高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)，分析其機(jī)制可能是FOXM1 表達(dá)升高抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了結(jié)腸癌進(jìn)展，從而影響患者的預(yù)后。

本研究的Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中PUM1 與FOXM1 表達(dá)呈正相關(guān) （r＝0.514，P＜0.05），推測(cè)兩者在結(jié)腸癌中可能存在正向調(diào)控機(jī)制，共同參與了結(jié)腸癌的發(fā)生和進(jìn)展，并可影響患者的預(yù)后，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究揭示。本研究的多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1、PUM1、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期及分化程度均是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這進(jìn)一步證明了PUM1 和FOXM1 與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，兩者均有潛力作為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

綜上所述，PUM1、FOXM1 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)均顯著升高且呈正相關(guān)，兩者與有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度及有無(wú)脈管癌栓均有相關(guān)性，且均是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)腸癌組織中PUM1 和FOXM1 表達(dá)均有潛力作為結(jié)腸癌診斷和預(yù)測(cè)患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。