人參多糖調控Wnt3/β-catenin/Runx2信號通路改善去卵巢大鼠骨質疏松的作用

李高峰 王藝昧 李光淳 張揚 王博 杜彥輝 桑平*

1.吉林省人民醫院創傷骨病二科,吉林 長春 130021 2.吉林大學第一臨床醫院病理科,吉林 長春 130021

骨質疏松癥是一種全身性骨代謝疾病,在絕經后女性及老年人群中發病率較高[1]。研究發現[2],骨質疏松癥發病率在我國50歲以上人群中為19.2%,且女性發病風險遠高于男性,尤其是65歲以上女性人群中發病率高達51.6%。絕經后女性骨質疏松癥常用的治療方法是補充雌激素,但會使子宮內膜癌、乳腺癌等激素依賴性腫瘤及心血管疾病的發病風險增加[3]。降鈣素、雙膦酸鹽等藥物也用于絕經后女性骨質疏松癥的防治,但長期使用會出現胃腸道不適、乏力、頭暈及惡心、嘔吐等明顯的毒副作用,且遠期療效難以讓人滿意[4]。近年來,中藥由于具有多靶點、多通路及多途徑的作用特點,加之毒副作用較低,在防治絕經后女性骨質疏松癥領域逐漸引起了眾多研究者的關注[5-6]。

人參為五加科人參屬植物,是我國名貴的中藥材,應用歷史悠久。人參的主要活性物質包括皂苷、揮發油、多糖及黃酮等,具有抑制腫瘤生長、抗衰老、改善糖脂代謝紊亂、增加免疫力、保護心腦血管、興奮神經中樞及抗疲勞等生物學功能[7]。人參防治骨質疏松作用也多見報道[8]。馬偉鳳等[9]研究發現,人參皂苷Rg3能夠改善骨質疏松老年大鼠骨微結構、提高骨密度,其可能是通過調節自噬發揮骨保護作用。Kang等[10]研究證實,去卵巢小鼠經人參與甘藍聯合治療后,骨質疏松癥得到明顯改善。人參多糖作為人參中的主要水溶性功效物質,其提升免疫能力、加快新陳代謝速度、降低氧化應激水平及抑制炎癥反應等活性已被證實,但其是否具有改善絕經后女性骨質疏松癥作用目前未見報道[11-12]。因此,本研究選擇去卵巢骨質疏松大鼠模型,探究人參多糖是否具有改善去卵巢大鼠骨質疏松作用及潛在機制,以期為人參多糖應用于絕經后女性骨質疏松癥的防治及人參多糖的綜合開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物:雌性SPF級SD大鼠50只,體質量(200±20) g,購自吉林大學實驗動物中心[SCXK(吉)2021-0001]。大鼠飼養于吉林大學藥學院[SYXK(吉)2022-0017],自由飲水進食,環境濕度45%～50%,環境溫度21℃～25℃,每5 min換氣通風1次,每12 h光暗交替。本研究經吉林省人民醫院倫理委員會審批,各項操作均符合3R原則。

1.1.2主要試劑:人參多糖(批號BNK062),含量≥80%,西安百年康生物科技有限公司;阿侖膦酸鈉維生素D3(國藥準字H20110079),規格70 mg/片,石藥集團歐意藥業有限公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(批號:M027),上海歌凡生物科技有限公司;耐酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRAP-5b)、骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(OC)及骨保護素(OPG)檢測試劑盒(批號:H415-1、H234、H152-1-2及H286),南京建成生物工程研究所;Wnt3、β-連環蛋白(β-catenin)、Runt相關轉錄因子2(Runx2)及β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體(批號:ab32249、ab32249、ab23981及ab8227),美國Abcam公司;IgG二抗(批號:C86-SSA004),上海創賽科技有限公司。

1.1.3主要儀器:BT25S型分析天平,德國Sartorius公司;TGL-16M型高速冷凍臺式離心機,上海盧湘儀離心機儀器公司;STM7-BSW型顯微鏡,日本Olympus公司;Xpert/parameter型小動物高分辨率全自動X光機,美國KUBTEC公司;3510-AT型生物力學儀,美國BOSE公司;Mk3型酶標儀,美國Thermo公司;BC-2800型小動物全自動生化分析儀,深圳邁瑞生物醫療公司;JY-ZY5型電泳儀及JY-SCZ2型轉膜儀,北京君意東方電泳儀器公司;HW08921型成像儀,上海勤翔科學設備公司。

1.2 方法

1.2.1造模及分組:將已適應環境1周的SD大鼠按體質量隨機分為假手術組、模型組、人參多糖低、高劑量組(100、200 mg/kg)及阿侖膦酸鈉維生素D3組(6.25 mg/kg),每組10只,人參多糖的劑量參考文獻[13],阿侖膦酸鈉維生素D3的劑量參考文獻[14]。模型組、人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠均切除雙側卵巢,假手術組大鼠僅切除卵巢周圍脂肪組織。術后注射青霉素預防感染,同時恢復性飼養1周后,開始灌胃給予人參多糖或阿侖膦酸鈉維生素D3,每天1次,連續12周。假手術組及模型組用相同體積的蒸餾水灌胃,每周記錄各組大鼠體質量。

1.2.2樣本收集:實驗結束后,腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,腹主動脈采血。在冰上放置30 min后,低溫離心(2 000 r/min,20 min),吸取上清液,分裝后置于-80℃冰箱中保存。用手術剪刀分離脛骨及股骨,左側脛骨用4%甲醛溶液固定,右側脛骨及雙側股骨均在-80℃冰箱中保存備用。

1.2.3指標檢測:(1)骨組織病理形態觀察。各組大鼠左側脛骨在4%甲醛溶液中固定2周,先后經脫鈣、包埋、切片等操作,行HE染色,在顯微鏡下觀察人參多糖對骨組織病理形態的影響。(2)骨密度檢測。取各組大鼠左側股骨,通過小動物高分辨率全自動X光機對各組大鼠股骨骨密度進行檢測。(3)骨生物力學指標檢測。使用游標卡尺測量各組大鼠右側股骨長度,在生物力學儀中將股骨標本固定,壓頭以2 mm/min速度下降,直至股骨斷裂為止,記錄剛度、最大應力及最大載荷等數據。(4)血清骨代謝指標及生化指標檢測。取-80℃冰箱中凍存的血清,按照試劑盒說明書的操作步驟,血清TRAP-5b、BALP、OC及OPG等骨代謝指標的檢測采用酶聯免疫吸附法;通過小動物全自動生化分析儀檢測血清P3+、Ca2+等生化指標。(5)骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達檢測。取各組大鼠右側脛骨100 mg,加入1 mL RIPA裂解液,提取總蛋白,并通過BCA法測總蛋白含量。取20 μg蛋白樣品行SDS-PAGE電泳,電泳結束后轉至PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉。TBST洗膜后,加入稀釋2 000倍的Wnt3、β-catenin、Runx2及β-actin多克隆抗體,在4℃環境下放置過夜。TBST洗膜后,再加入稀釋5 000倍的IgG二抗,在室溫環境下放置2 h。采用化學發光法顯色,并通過Image J軟件分析凝膠條帶灰度值,計算目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 人參多糖對骨質疏松大鼠體質量的影響

造模前,各組大鼠體質量差異無統計學意義(P>0.05);造模后,假手術組大鼠體質量緩慢穩步增長,模型組大鼠體質量增長迅速,與假手術組比較,從第4周開始模型組大鼠體質量明顯升高(P<0.05,P<0.01)。人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠體質量增長速度慢于模型組,與模型組比較,人參多糖低、高劑量組大鼠體質量從第8周開始、阿侖膦酸鈉維生素D3組從第4周開始均明顯降低(P<0.05,P<0.01),見表1。

表1 人參多糖對骨質疏松大鼠體質量的影響Table 1 Effect of ginseng polysaccharide on the body mass in osteoporosis rats n=10)

2.2 人參多糖對骨質疏松大鼠骨組織病理形態的影響

假手術組大鼠骨組織形態正常;模型組大鼠骨小梁間隙變寬,骨小梁疏松變薄;人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠骨小梁連接和數量增加明顯,其中人參多糖高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠骨小梁接近正常,見圖1。

圖1 各組大鼠骨組織病理形態(HE,×200)Fig.1 Histopathologic morphology of the bone in each group (HE, ×200)

2.3 人參多糖對骨質疏松大鼠骨密度的影響

與假手術組比較,模型組大鼠骨密度降低了20.39%(P<0.01);與模型組比較,人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠骨密度分別增加了8.81%、11.28%及18.57%(P<0.01),見表2。

表2 人參多糖對骨質疏松大鼠骨密度的影響Table 2 Effect of ginseng polysaccharide on bone mineral density in osteoporosis rats n=10)

2.4 人參多糖對骨質疏松大鼠骨生物力學指標的影響

人參多糖對骨質疏松大鼠骨生物力學指標剛度、最大應力及最大載荷等的影響見表3。模型組大鼠剛度、最大應力及最大載荷與假手術組比較均明顯下降(P<0.01);與模型組比較,人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠剛度、最大應力及最大載荷均明顯增加(P<0.05,P<0.01)。

表3 人參多糖對骨質疏松大鼠骨生物力學指標的影響Table 3 Effect of ginseng polysaccharide on bone biomechanical indexes in osteoporosis rats n=10)

2.5 人參多糖對骨質疏松大鼠血清骨代謝指標的影響

人參多糖對骨質疏松大鼠血清骨代謝指標TRAP-5b、BALP、OC及OPG等的影響見表4。與假手術組比較,模型組大鼠血清TRAP-5b含量明顯升高(P<0.01),而BALP、OC及OPG含量明顯降低(P<0.01);與模型組比較,人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠血清TRAP-5b含量明顯降低(P<0.05,P<0.01),而BALP、OC及OPG含量明顯升高(P<0.01)。

表4 人參多糖對骨質疏松大鼠血清骨代謝指標的影響Table 4 Effect of ginseng polysaccharide on the serum bone metabolism indexes in osteoporosis rats n=10)

2.6 人參多糖對骨質疏松大鼠血清生化指標的影響

人參多糖對骨質疏松大鼠血清生化指標P3+、Ca2+等含量的影響見表5。模型組大鼠血清P3+、Ca2+含量與假手術組比較均明顯下降(P<0.01);與模型組比較,人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠血清P3+、Ca2+含量均明顯增加(P<0.05,P<0.01)。

表5 人參多糖對骨質疏松大鼠血清生化指標的影響Table 5 Effect of ginseng polysaccharide on the serum biochemical indexes in osteoporosis rats n=10)

2.7 人參多糖對骨質疏松大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達的影響

采用Western blot法檢測人參多糖對骨質疏松大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達的影響,見圖2及表6。與假手術組比較,模型組大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達均明顯下降(P<0.01);與模型組比較,人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達均明顯增加(P<0.05,P<0.01),提示人參多糖具有激活去卵巢骨質疏松大鼠Wnt3/β-catenin/Runx2信號通路的作用。

圖2 各組大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達Fig.2 Expressions of Wnt3, β-catenin, and Runx2 in the bone tissue of rats in each group

表6 人參多糖對骨質疏松大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達的影響Table 6 Effect of ginseng polysaccharide on the expressions of Wnt3, β-catenin, and Runx2 of the bone tissue in osteoporosis rats

3 討論

雌激素水平下降,機體的骨形成弱于骨吸收,進而使骨穩態失衡是導致絕經后女性骨質疏松癥發病的首要原因[15]。去卵巢大鼠常用于模擬絕經后女性骨質疏松癥,該方法具有操作簡便易行、重復性好、周期較短及成功率高等優點,是美國食品藥品監督管理局和世界衛生組織推薦的經典模型[16]。本研究結果發現,去卵巢模型組大鼠骨小梁間隙變寬、骨小梁疏松變薄,骨密度及剛度、最大應力、最大載荷等骨生物力學指標下降,較好地模擬了絕經后女性骨質疏松癥的病理特征,提示模型復制成功。既往研究發現,去卵巢后機體雌激素水平驟減,反饋性導致腎上腺皮質功能亢進,引起激素分泌紊亂,使糖脂代謝能力下降,進而造成體質量增加[17];本研究中的去卵巢模型組大鼠體質量明顯增加,進一步表明成功建立了大鼠骨質疏松癥模型。骨密度是診斷骨質疏松癥的重要指標,其含量下降預示骨折及患骨質疏松癥風險增加;剛度、最大應力、最大載荷等骨生物力學指標可以反映骨骼抵抗彎曲變形能力及抵抗外力的最大力量,相關指標降低說明骨折出現的風險增加[18]。去卵巢大鼠經低、高劑量的人參多糖連續干預12周后發現,人參多糖低、高劑量組大鼠體質量下降,骨小梁連接和數量增加,骨密度及剛度、最大應力、最大載荷等增加,表明人參多糖具有改善去卵巢大鼠骨質疏松的作用。

TRAP是評價骨吸收速率的生物標志物,主要由破骨細胞分泌;BALP、OC為反映骨形成的重要指標,主要由成骨細胞分泌;OPG的主要作用是增加骨強度、骨密度及抑制骨吸收[19]。既往研究發現,升高BALP、OC含量,促進OPG表達,抑制TRAP活性,是多種藥物治療骨質疏松癥的重要策略[20]。血清P3+、Ca2+等是骨轉換的常見指標,當血清P3+、Ca2+含量降低時預測可能存在骨丟失,其可作為間接反映骨質疏松嚴重程度的指標,而增加血清P3+、Ca2+含量是緩解骨質疏松癥的有效途徑[21]。人參中的皂苷成分可以通過增加BALP、OC、OPG含量及減少TRAP含量等改善骨質疏松癥狀[8-9,22];人參根飲液對模型大鼠骨質疏松的改善作用與調節P3+及Ca2+含量有關[23]。本研究結果發現,人參多糖各劑量組大鼠血清TRAP-5b含量減少,而BALP、OC、OPG及P3+、Ca2+含量升高,表明人參多糖可以調節骨代謝及增加骨礦鹽含量,進一步提示其具有改善去卵巢大鼠骨質疏松的作用。

Wnt/β-catenin信號通路在骨質疏松癥的發生中具有關鍵性作用,其與骨重建和骨形成均密切相關,因此調控該信號通路對于改善骨質疏松癥的發生和進展有著積極意義[24-26]。Wnt活化后可促進β-catenin與淋巴增強因子/T細胞轉錄因子結合而形成復合體,從而進一步上調下游靶基因Runx2的表達及轉錄[27]。Runx2可使各種礦化相關蛋白基因的轉錄及表達增加,促進成骨向分化[28]。研究發現,破骨細胞中的β-catenin被條件敲除時,可導致骨吸收程度顯著增加;刺激β-catenin過量表達,則能夠使骨量升高,提示Wnt/β-catenin信號通路可抑制骨吸收,進而促進成骨細胞的礦化和分化[29]。周哲人等[30]研究發現,木犀草素和柚皮苷均可以上調大鼠骨髓間充質干細胞中β-catenin和Runx2 mRNA的表達,誘導骨髓間充質干細胞的成骨分化。白堅木醇也能夠促進MC3T3-E1細胞中β-catenin和Runx2 mRNA及蛋白的表達,其促進成骨細胞形成的機制與Wnt/β-catenin/Runx2信號通路有關[31]。本研究結果同樣發現,人參多糖低、高劑量組大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達均明顯增加,表明其可能通過激活Wnt3/β-catenin/Runx2信號通路發揮改善去卵巢大鼠骨質疏松作用。

綜上所述,人參多糖可以減輕去卵巢大鼠骨組織病理形態,增加骨密度及骨生物力學指標,調節骨代謝,升高骨礦鹽含量,具有改善骨質疏松作用。進一步的機制研究發現,人參多糖改善去卵巢大鼠骨質疏松作用可能與激活Wnt3/β-catenin/Runx2信號通路有關。本研究的相關結果將為骨質疏松癥的防治提供新的手段和方法,也將有利于人參多糖的綜合開發應用。