氯化鋰對OVX小鼠骨丟失和JAK/STAT3信號通路的影響

張浦燊 蘆泊帆 胡云鵬 連強強 侯曉麗 邢磊 王玉丹 張柳 田發明*

1.華北理工大學公共衛生學院,河北 唐山 063210 2.河北醫科大學基礎醫學院,河北 石家莊 050011 3.國家礦山醫療救助中心應急總醫院骨科,北京 100028

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨密度(bone mineral density,BMD)降低、骨組織微結構受損為特征的全身性骨代謝疾病,同時發生脆性骨折的概率增加[1-2]。目前已有動物實驗證實氯化鋰(lithium chloride,LiCl)對OP有一定的治療潛能,可以顯著促進小鼠骨形成,改善骨骼質量[3-5]。

JAK/STAT3信號通路參與多種骨相關疾病的發生發展[6]。Sun等[7]發現JAK/STAT信號通路與OP關系密切,在成骨細胞(osteoblast,OB)分化過程中都具有重要作用[8]。STAT3可能增強Treg介導的抑炎作用,從而促進骨折愈合[9];JAK2/STAT3通路的活化可以促進骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向OB分化,加速骨再生和骨缺損愈合[10]。此外,Davidson等[11]研究表明,STAT3基因敲除小鼠的BMD和骨形成率顯著下降。

基于以上筆者推測在相關因素刺激下OB的JAK/STAT3信號通路活性異常參與了OP的進展,而LiCl通過對該信號通路活性的調控最終延緩了OP的進程。本研究擬以OVX小鼠作為觀察對象,通過動物模型建立、OB培養,結合LiCl干預,初步探討LiCl對JAK/STAT3信號通路活性的調控作用以及防治OP的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物:8周齡C57BL6/J小鼠24只(購自華北理工大學實驗動物中心,實驗動物生產和使用許可NCSTALBS014)。隨機將小鼠分為3組:假手術組(Sham組)、骨質疏松模型組(OVX組)、氯化鋰干預組(OVX+LiCl組)。Sham組僅開腹后即縫合腹膜,而OVX與OVX+LiCl組則行雙側卵巢摘除術。OVX+LiCl組每日進行LiCl(100 mg/kg)腹腔注射,而Sham組與OVX組則給予等體積鹽水注射,8周后取材。

1.1.2實驗細胞:8周齡健康C57BL6/J小鼠,1對2只,適應性喂養1周后配籠繁殖,取新生3 d的乳鼠備用。采用DMEM培養基在體積分數為10%的無菌胎牛血清、1%的青-鏈霉素的培養液中以植塊法培養原代OB,傳代培養至第2代后,取對數生長期細胞進行實驗,將細胞分為空白對照組(Control組)和LiCl組兩組,實驗組給予5 mmol/L LiCl干預。

1.1.3主要試劑:0.9%氯化鈉注射液、PBS(北京索萊寶)、甲醛溶液、胰酶(北京索萊寶)、碘伏消毒液(500 mL)、NaOH顆粒、無水乙醇、二甲苯、低熔點石蠟(58℃～60℃)、高熔點石蠟(62℃～67℃)、一抗體稀釋液(上海博士德)、DAB顯色試劑盒(中杉金橋)、二抗 PV-6001試劑盒(中杉金橋)、內源性過氧化物酶阻斷劑(上海博士德)。

1.2 實驗方法

1.2.1樣本采集:將右側股骨和脛骨在4%的甲醛中固定;兩天后右側脛骨轉移至70%乙醇中4℃保存用以Micro-CT分析骨微結構;左側股骨迅速用0.9%氯化鈉溶液浸潤的無菌紗布包裹,在-80℃凍存,用于三點彎曲試驗。

1.2.2脛骨Micro-CT檢測:掃描Micro-CT采用8.99μm3的分辨率,采用Bruker公司(比利時)的Sky Scan1176型Micro-CT進行,松質骨感興趣區域為小鼠右側脛骨生長板下50層,整個區域的厚度為0.5 mm;皮質骨的感興趣區域從松質骨所選區域后200層開始,繼續計數100層。分析時使用Bruker公司所兼容的軟件進行。

1.2.3股骨三點彎曲試驗:將標本放在試驗機支撐物中心,跨距為8 mm。設定參數值2 N,2 mm/min的恒定位移速率,試驗機停止的終點為股骨斷裂。整個實驗操作采用SHIMDZU日本公司的萬能電子試驗機進行,主要指標包括最大載荷和最大應力。

這第二種“正在形成或者繼續重建”的結構與存在論中的建構結構似乎具有某些相通之處。前提是，如果我們以存在主義觀點而非生物主義觀點來給這第二種結構定下基調——從人的活動即“此在”結構出發，就可以將“民間故事活動”看成一個“開放的活的”結構系統，始終處于未封閉的形成過程中，并通過不斷的交流進行調節達到暫時平衡。[注]此觀點詳見張瓊潔《當代民間故事活動價值發生研究》，《民族文學研究》，2018年，第1期。

1.2.4免疫組織化學染色檢測P-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達情況:將Micro-CT檢測完的脛骨標本脫鈣完成后,脫蠟水化,抗原修復,阻斷內源性過氧化物酶,一抗、二抗孵育,DAB顯色,蘇木素復染,脫水,封固,顯微鏡下觀察染色結果。本實驗應用圖像分析專業軟件Image Pro Plus(Med.Cybern,Inc,US)對圖片進行分析,免疫組化染色強度用平均光密度(IOD/mm2)表示。由3人組成的實驗小組自主獨立采集數據,取3人平均值進行分析。

1.2.5CCK8法檢測原代OB的增殖活性:待第二代的OB生長密度為80%～85%時,消化后以每孔3×103cell/mm2的密度接種于96孔板中,分為4組,每組設置7個復孔,24 h之后將培養基分別更換為不含LiCl、含LiCl(2.5、5、10 mmol/L)的培養基,培養箱保持37℃,5%CO2的環境,分別繼續培養1、3、5 d后,每孔加入10 μL的CCK8檢測試劑,避光孵育1 h,放置到酶標儀中在波長450 nm處檢測,測量吸光度(OD值)。

1.2.7茜素紅染色檢測OB分化能力:茜素紅染色步驟同ALP染色,確認染色良好后進行光鏡下觀察并照相。隨后進行半定量檢測,每孔加入1 mL 10%氯化十六烷基吡啶置在37℃溫箱下放30 min,然后吸掉上清,使用分光光度計,在波長560 nm處測樣本吸光值,用氯化十六烷基吡啶溶液調零。

1.2.8實時熒光定量PCR檢測OB中STAT3 和OCN mRNA水平:提取總RNA后進行純度以及濃度檢測,反轉錄合成cDNA,Real-time PCR反應,根據Takara說明書進行操作,檢測骨鈣素(osteocalcin,OCN)和STAT3 mRNA的表達。各基因的引物序列見表1,由吉瑪公司設計、合成。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.3 統計學方法

結果數據采用SPSS 17.0軟件進行統計計算,全部計量數據以均數±標準差表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較用單因素方差分析,P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨形態學參數

Mirco-CT分析結果見表2,三維重建結構見圖1。松質骨結果顯示,OVX 組的BMD、骨體積(bone volume,BV)、骨小梁相對體積(bone volume/tissue volume,BV/TV)、骨小梁數量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)均顯著低于Sham組(P<0.05);OVX+LiCl組的BMD、BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明顯低于Sham組(P<0.05);與OVX組相比,OVX+LiCl組的BMD和Tb.Sp顯著升高(P<0.05)。皮質骨結果顯示,OVX+LiCl組和OVX組的皮質骨面積(cortical bone area,Ct.Ar)較Sham組明顯下降,差異有統計學意義(P<0.05),OVX+LiCl組相較于OVX組和Sham組Ct.Po顯著升高(P<0.05)。

圖1 干預2個月后各組三維骨重建情況注:A:Sham組;B:OVX組;C:LiCl組。Fig.1 Three-dimensional bone reconstruction in each group after 2 months of interventionA: Sham group; B: OVX group; C: LiCl group.

表2 各組松質骨、皮質骨參數Table 2 Cancellous and cortical bone parameters in each group n=6)

2.2 LiCl對骨骼力學的影響

OVX 組的最大載荷、最大應力均明顯低于Sham組(P<0.05),OVX+LiCl組的最大載荷、最大應力較OVX組明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組LiCl對骨骼力學的影響Table 3 Effects of lithium chloride on the skeletal mechanics in each group n=6)

2.3 P-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達情況

P-STAT3、JAK2、STAT3的蛋白主要分布于骨小梁表面OB內。免疫組織化學染色定量分析檢測P-STAT3的表達分析結果示OVX組的平均光密度均明顯低于Sham組(P<0.05),OVX+LiCl組的平均光密度較OVX組明顯升高(P<0.05)。JAK2、STAT3的表達分析結果示OVX+LiCl 組的平均光密度較OVX組明顯升高(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 干預2個月后各組P-STAT3、JAK2、STAT3蛋白免疫組織化學染色情況(光鏡下400倍放大)Fig.2 Immunohistochemical staining of P-STAT3, JAK2, and STAT3 proteins in three groups after 2 months of intervention (scale bar: 400× magnification)

表4 干預2個月后各組P-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達情況Table 4 Protein levels of P-STAT3, JAK2, and STAT3 in three groups after 2 months of intervention IOD/mm2, n=3)

2.4 LiCl增強OB增殖能力

在第3、5天,2.5 mmol/L LiCl組的OB增殖顯著高于Control組(P<0.05)。而每個時間點5 mmol/L LiCl組的OB增殖顯著高于Control組(P<0.05),故后續實驗LiCl濃度均為5 mmol/L。見表5。

表5 各組LiCl增強OB增殖能力Table 5 Lithium chloride enhances the proliferation of osteoblasts in each group n=7)

2.5 LiCl增強OB分化能力

LiCl組的ALP活性顯著升高,與Control組比較,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3、表6。LiCl組的茜素紅染色可見紅色礦化鈣結節形成,LiCl組的紅色礦化結節較多,而Control組只可見少量礦化結節,見圖4、表6。

圖3 兩組OB細胞ALP染色情況(光鏡下100倍放大)注:A:Control組;B:LiCl組。Fig.3 Results of ALP staining of OB in two groups (scale bar: 100× magnification)A: Control group; B: LiCl group.

圖4 兩組OB茜素紅染色結果(光鏡下100倍放大)注:A:Control組;B:LiCl組。Fig.4 Results of Alizarin red staining of OB in two groups (Scale bar: 100× magnification)A: Control group; B: LiCl group.

表6 各組LiCl增強OB分化能力Table 6 Lithium chloride enhances the differentiation of osteoblasts in each group n=3)

2.6 STAT3和OCN mRNA水平檢測結果

用LiCl干預OB 7 d,與Control組相比,LiCl組的STAT3 mRNA和OCN mRNA表達顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表7。

表7 各組OB中STAT3 mRNA和OCN mRNA水平檢測結果Table 7 The results of STAT3 mRNA and OCN mRNA levels n=3)

3 討論

OP的重要危險因素包括抑郁癥,與健康者相比,絕經后女性精神障礙患者BMD顯著降低[12-13]。研究表明,LiCl治療精神障礙患者的同時,其骨量增加,骨轉化率降低[14]。JAK/STAT3信號通路激活可以逆轉OVX小鼠的骨丟失[15]。初步探討LiCl對JAK/STAT3信號通路的作用,可以更深入地研究LiCl的作用機制,使其更好地應用于臨床,在治療精神障礙疾病的同時亦可預防OP發生。

Micro-CT的指標能夠間接反映骨代謝狀況,是皮質骨和松質骨骨量評價常用的指標[16-18]。本實驗Micro-CT的結果顯示,OVX+LiCl組相較于OVX組BV/TV增加,Tb.Sp降低,說明LiCl干預后BV/TV升高,Tb.Sp降低,OP程度有較明顯改善。但在Bai等[19]的研究中,LiCl對Tb.N、Tb.Sp、SMI等參數的改善作用更為顯著,這可能和本研究所選用的LiCl的劑量以及實驗動物的種屬有關。Zhang等[20]認為100 mg/kg的LiCl干預小鼠可以抑制GSK3β的表達,因此本研究選用了該劑量,根據上述結果,100 mg/kg的LiCl可能并非干預小鼠的最適劑量。

皮質骨的結構和材料參數對于骨骼的力學性能更具有決定意義[21]。提高Ct.Po會降低骨強度,Ct.Po增加4%可導致骨裂隙提高84%[22]。而Ct.Po從4%升高到10%會使骨靜態壓縮載荷下降50%[23]。Ct.Po從4%升高到20%時,未產生裂隙前的骨應力會降低3倍[24]。本實驗OVX+LiCl組同OVX組相比,Ct.Po顯著降低,而生物力學的最大載荷和最大應力均明顯升高,說明Ct.Po降低時生物力學的最大載荷和最大應力會顯著升高,這表明LiCl對OP的皮質骨的骨重建是有一定療效的,而Sham組和OVX組相比,無顯著差異的原因可能和不同狀態下骨組織的結構及代謝調節機制有關。

利拉魯肽通過活化STAT3對糖尿病骨質疏松大鼠骨代謝產生正向作用[25]。也有研究認為JAK2/STAT3信號通路對OP的作用是負向的,JAK2/STAT3信號途徑可以降低BMD,抑制骨小梁形成從而促進OP的發生[26]。有文獻提出,LiCl降低了P-STAT3的表達,從而抑制了STAT3的活性[27]。在本研究中,免疫組織化學分析發現,OVX+LiCl組JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達較OVX組顯著升高,表明LiCl對OVX小鼠骨丟失的抑制作用可能與其對JAK2/STAT3信號通路的調控有關,但該信號通路在此過程中是否發揮關鍵作用尚有待進一步實驗證實。

此外,觀察不同濃度LiCl干預相同時間后OB活性的變化,結果顯示LiCl在2.5、5 mmol/L濃度對OB的生長均有不同程度的促進作用,隨著干預濃度的增加,OB活性相較于空白組降低,10 mmol/L對OB生長的促進作用最弱,但仍然對OB存在促進增殖的效果。這一結果同Laiuppa等[28]發現在體外環境培養下,低濃度LiCl可以促進大鼠脂肪干細胞增殖類似,證實在一定劑量范圍內,LiCl以劑量依賴的方式促進OB增殖。

OB是骨形成的主要功能細胞,負責細胞外基質的合成、分泌和礦化[29-30]。因此,本實驗通過ALP和茜素紅染色評估LiCl對OB 功能的影響,證明LiCl能增強ALP的活性和表達以及促進礦化結節的產生。OCN mRNA的轉錄和蛋白合成是OB分化成熟進入礦化期的主要指征之一[31]。本實驗LiCl處理OB培養7 d后,LiCl組OB中OCN mRNA表達升高,表明LiCl能促進OB中OCN的表達。此外,LiCl干預7 d后,OB中STAT3 mRNA表達顯著高于對照組,提示LiCl可以對OB中的STAT3基因起到促進作用,以上結果和Shi等[32]的研究LiCl能夠調節miR-337對STAT3的抑制效果類似。

本研究結果表明LiCl尚未達到最適劑量,然而LiCl治療量與中毒量很接近,當血鋰濃度過高時可能誘發中毒反應,選擇恰當劑量的LiCl既能達到治療效果又可避免中毒反應,對于公共衛生預防和臨床應用仍是需要進一步探討的話題。

綜上,LiCl通過調控OB改善OVX小鼠骨量和骨微結構,其機制可能與調節JAK/STAT3信號通路有關,但該信號通路在其中是否發揮關鍵作用,LiCl對骨代謝尤其是OB功能的影響是否有其他信號通路的參與,仍有待進一步研究。